Efecto de la inoculación de Pseudomonas sp. TF716 sobre emisiones de N2O durante la rizorremediación de diésel

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13018 (2022) Citar este artículo

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Ha aumentado la demanda de tecnología de rizorremediación que pueda minimizar las emisiones de gases de efecto invernadero y al mismo tiempo eliminar eficazmente los contaminantes para mitigar el cambio climático. El efecto de la inoculación de Pseudomonas sp. Se investigó el TF716 sobre las emisiones de N2O y el desempeño de la remediación durante la rizorremediación de suelos contaminados con diesel plantados con festuca alta (Festuca arundinacea) o maíz (Zea mays). Pseudomonassp. TF716 se aisló del suelo de la rizosfera de festuca alta. La tasa máxima de reducción de N2O de TF716 fue de 18,9 mmol N2O g de células secas-1 h-1, que es superior a las tasas reportadas previamente para Pseudomonas spp. Cuando Pseudomonas sp. Se agregó TF716 al suelo contaminado con diesel plantado con festuca alta, el potencial de reducción de N2O del suelo fue 2,88 veces mayor que el del suelo sin inoculación durante el período inicial (0 a 19 días), y de 1,08 a 1,13 veces mayor a partir de entonces. Sin embargo, no hubo mejora en el potencial de reducción de N2O para el suelo plantado con maíz después de la inoculación con la cepa TF716. Además, la inoculación de TF716 no afectó significativamente la degradación del diesel durante la rizorremediación, lo que sugiere que la actividad de los microorganismos involucrados en la degradación del diesel no se vio afectada por el tratamiento con TF716. El análisis de la dinámica de los géneros bacterianos asociados con la reducción de N2O mostró que Pseudomonas tuvo la mayor abundancia relativa durante la rizorremediación de suelo contaminado con diesel plantado con festuca alta y tratado con la cepa TF716. En general, estos resultados sugieren que las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel utilizando festuca alta pueden reducirse con la adición de Pseudomonas sp. TF716.

El petróleo es la fuente de energía más utilizada a nivel mundial, y los hidrocarburos de petróleo (PH) pueden filtrarse al suelo y al agua subterránea durante su almacenamiento, transporte y uso, amenazando el medio ambiente1,2,3. Los PH que contaminan el suelo no sólo alteran el equilibrio ecológico sino que también dañan el paisaje circundante y emiten olores, provocando daños estéticos y económicos4,5. De las diversas tecnologías de remediación de suelos que se han propuesto, la rizorremediación es particularmente prometedora porque puede acelerar la biodegradación de los PH aprovechando la estrecha interacción entre las raíces de las plantas y los microorganismos rizosféricos1.

En la rizorremediación de suelos contaminados con PH, generalmente se agregan fuentes de nitrógeno para mejorar la eficiencia de la biodegradación, lo que puede resultar en emisiones de óxido nitroso (N2O)6. El amonio del suelo suele ser nitrificado y luego desnitrificado por microorganismos y emitido a la atmósfera en forma de N2. Sin embargo, si no se produce la reducción de N2O, un metabolito intermedio, a N2, se puede liberar N2O6,7,8. El N2O es un importante gas de efecto invernadero con un potencial de calentamiento global (GWP) aproximadamente 298 veces mayor que el del CO29. Una vez descargado a la atmósfera, el N2O tiene un largo tiempo de residencia de unos 121 años9 y es un precursor del óxido nítrico (NO), que destruye la capa de ozono en la estratosfera mediante reacciones fotoquímicas10,11.

Como parte del objetivo de eliminar los contaminantes ambientales como respuesta al cambio climático, es necesario minimizar las emisiones de N2O durante la remediación de suelos contaminados con PH. Una solución útil a este respecto es utilizar activamente bacterias que puedan reducir el N2O a N2. Por lo tanto, en el presente estudio, se evaluó el efecto de una bacteria reductora de N2O sobre las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con PH. Se extrajo un aislado bacteriano con excelente capacidad de reducción de N2O de un caldo enriquecido que empleaba suelo de rizosfera como fuente de inóculo, y se suministró N2O como aceptor final de electrones. Se evaluó el efecto de la inoculación de la bacteria aislada sobre el potencial de reducción de N2O de muestras de suelo para la rizorremediación de suelos contaminados con PH plantados con festuca alta (Festuca arundinacea) o maíz (Zea mays). Además, también se investigó el efecto de la inoculación del aislado sobre la eficiencia de eliminación de PH, el crecimiento de las plantas y la comunidad bacteriana del suelo asociada con la reducción de N2O.

Una muestra de suelo (2 g) obtenida de la rizosfera de festuca alta (F. arundinacea) se suspendió en 200 ml de un medio mineral que contenía KH2PO4 (169,7 mg L-1), MgSO4·7H2O (751,1 mg L-1), CaCl ·2H2O (451.6 mg L-1), EDTA (5.0 mg L-1), FeSO4·7H2O (5.0 mg L-1) y 1 mg L-1 de una solución de oligoelementos. La solución de oligoelementos contenía ZnSO4·7H2O (0,43 mg L-1), CoCl2·6H2O (0,24 mg L-1), MnCl2·4H2O (0,99 mg L-1), CuSO4·5H2O (0,25 mg L-1), Na2MoO4. ·2H2O (0,22 mg L-1), NiCl2·6H2O (0,19 mg L-1) y Na2SeO4 (0,21 mg L-1). El pH del medio se ajustó a 7 con soluciones de NaOH 1 M y HCl 1 M. La suspensión del suelo se añadió a una botella de suero de 1,2 litros y luego se selló con un tapón de caucho butílico después de purgar con gas N2 para mantener las condiciones anaeróbicas. Se agregaron al frasco soluciones madre estériles de glucosa y acetato de sodio como fuente de carbono con una jeringa hasta una concentración final de 100 mg L-1 cada una según la demanda química de oxígeno (DQO). Se inyectó gas N2O (99%; Dong-A Specialty Gases Co., Seúl, República de Corea) en la botella mediante una jeringa para ajustar la concentración final en el espacio de cabeza a 1000 ppm (v/v). La botella de suero se incubó a 30 °C con agitación a 120 rpm. La concentración de N2O se controló periódicamente mediante un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un detector de captura de microelectrones8. Cuando la concentración de N2O en el espacio de cabeza de la botella disminuyó por debajo de 10 ppm, se inyectó gas N2O adicional en la botella hasta una concentración en el espacio de cabeza de 1000 ppm (v/v). De esta manera se repitió la inyección de gas N2O otras seis veces. Después de esto, se transfirieron 40 ml del cultivo a una botella de suero que contenía 160 ml de medio mineral fresco. El cultivo transferido se incubó en las mismas condiciones descritas anteriormente. El consorcio de bacterias reductoras de N2O se obtuvo después de que el proceso de transferencia se repitiera cinco veces de la misma manera que se describe anteriormente.

El consorcio reductor de N2O se diluyó en serie con agua destilada estéril y se extendió sobre placas de agar Difco™ LB. El medio agar LB (pH 7,0) contenía triptona (10 g L-1), extracto de levadura (5 g L-1), NaCl (10 g L-1) y agar (15 g L-1). Las placas se incubaron a 30 °C durante 48 h. Luego, cada colonia se transfirió a una placa de agar LB nueva y se incubó en las mismas condiciones. Este proceso se repitió hasta obtener ocho colonias puras.

Luego se comparó la actividad de reducción de N2O de los ocho aislados. Los aislados se incubaron en 10 ml de caldo LB a 30 °C durante 24 h a 120 rpm en condiciones aeróbicas. Cada caldo de cultivo se centrifugó y el sedimento celular obtenido se enjuagó con agua destilada y se usó para preparar una suspensión celular con una densidad óptica (OD600 nm) de 1,0 en un medio mineral que contenía NaCl (8 g L-1), KCl (0,2 g L-1), Na2HPO4 (1,44 g L-1) y KH2PO4 (0,24 g L-1) (pH 7,0). La densidad óptica se midió espectrofotométricamente a 600 nm utilizando un espectrofotómetro Libra S22 (Biochrom, Cambridge, Reino Unido). Se añadió una alícuota de 1 ml de cada suspensión celular a una botella de suero de 120 ml que contenía 9 ml de medio mineral fresco. La botella se selló con un tapón de caucho butílico después de purgar con gas N2 y la fuente de carbono se añadió a la botella con una jeringa hasta una concentración final de 100 mg L-1 basada en la DQO. Se inyectó gas N2O en cada botella a una concentración de 1000 ppm y la concentración de N2O en el espacio de cabeza de la muestra se controló a lo largo del tiempo mediante un cromatógrafo de gases. Cada experimento se realizó por triplicado. El aislado con mayor actividad fue el aislado marcado TF716.

Para identificar el aislamiento TF716, se mezcló una colonia TF716 con 15 μl de agua esterilizada y se trató durante 3 minutos en un bloque calefactor a 95 °C. Después de eliminar los restos celulares mediante centrifugación (7500 x g), la muestra de ADN del sobrenadante obtenido se utilizó como plantilla para la PCR. Para apuntar al gen 16S rRNA, se utilizaron cebadores 340F y 805R para la amplificación8. Los productos de PCR fueron secuenciados por Macrogen (Seúl, República de Corea) y la secuencia resultante se analizó utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) desarrollada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se construyó un árbol filogenético molecular con las secuencias de ARNr 16S del aislado TF716 y bacterias conocidas que degradan el N2O y el aceite utilizando el software MEGA (versión 11, www.megasoftware.net) y un algoritmo de unión de vecinos.

Se caracterizaron los efectos de la concentración de N2O y el exudado radicular sobre la reducción de N2O por la cepa TF716. Se añadió una alícuota de una suspensión celular (1 ml) con una DO600 de 1,0 preparada de la manera descrita anteriormente a una botella de suero de 120 ml que contenía 9 ml de un medio mineral. La solución de carbón se inyectó en la botella después de purgarla y sellarla de la misma manera que se describió anteriormente. Para determinar el efecto de la concentración de N2O sobre la actividad de reducción de N2O de la cepa TF716, se inyectó gas N2O en la botella a una concentración de 200, 500, 750, 1000 o 1500 ppm.

El exudado de raíces de festuca alta (F. arundinacea) y maíz (Z. mays) se preparó de manera similar a la descrita en un artículo anterior12. Se tomaron muestras cuidadosamente de festuca alta y maíz, cultivados en suelo no contaminado, y se eliminó la tierra adherida libremente a la raíz sacudiendo la planta. Después de lavar con agua destilada (DW) varias veces, se agregaron 10 g de cada muestra de raíz a 100 ml de DW esterilizado y se mezclaron durante 2 h a 50 °C. Después de enfriar cada solución mixta a temperatura ambiente, la solución mixta se filtró con un filtro de 0,45 µm. Cada solución filtrada se utilizó como exudado radicular. La DQO del exudado de raíz de festuca alta y maíz fue de 750 y 780 mg L-1, respectivamente. Los compuestos del medio mineral también se añadieron al exudado de raíces en las mismas concentraciones que en el medio mineral para producir el medio de exudado de raíces. La suspensión celular se añadió a una botella de suero de 120 ml que contenía 9 ml de medio de exudado de raíz. Para el control, se añadió la fuente de carbono a todas las condiciones. Se inyectó gas N2O en cada botella hasta una concentración final de 1000 ppm. Todos los experimentos se realizaron a 30 °C con 120 rpm por triplicado. La tasa de reducción de N2O para cada condición experimental se calculó como se describe en un artículo anterior8. La tasa máxima de reducción de N2O (Vmax) y la constante de saturación (Km) se determinaron mediante gráficos de Lineweaver-Burk (Park et al., 2020). Las concentraciones celulares se determinaron a partir de la relación entre la densidad óptica medida a 600 nm y el peso seco de las células (DCW, g). Para determinar el peso seco de las células, las células de la suspensión celular se recogieron mediante centrifugación (7500 x g) y se secaron a 70 °C durante 24 h.

Se realizó un experimento en macetas para evaluar el efecto de la inoculación del aislado TF716 sobre el rendimiento de la rizorremediación de suelos contaminados con diésel plantados con festuca alta o maíz. Se recogió tierra de un jardín en la azotea del Nuevo Edificio de Ingeniería de la Universidad de Mujeres Ewha, Seúl, República de Corea (37°57′ N, 126°95′ E). La textura del suelo era franco-arenosa. Después de tamizar el suelo con un tamiz de 2 mm para eliminar malezas y piedras, el suelo se contaminó artificialmente con diesel en concentraciones iniciales de 10,000 mg-diesel kg-suelo-1. Luego, la tierra contaminada se almacenó en un lugar sombreado en la azotea durante siete días y se mezcló uniformemente una vez al día. Para proporcionar N y P, se añadió compost al suelo contaminado en una proporción de 1:19 (p/p). El compost se compró a un proveedor comercial (Seokgang Green Fertilizer Inc., Icheon, República de Corea) y consistía en estiércol de cerdo fermentado (40%), aserrín (49%), estiércol de vaca (10%) y el inóculo bacteriano ( 1%). Las concentraciones de NH4+–N, NO3–N y P total del suelo contaminado modificado con compost fueron 12,2, 15,7 y 1195,2 mg kg-suelo-1, respectivamente. El contenido de materia orgánica y el pH fueron 27,1% y 6,8, respectivamente. La suspensión celular del aislado TF716, que se preparó cultivando las células en el medio LB como se describe anteriormente, seguido de recolección y enjuague, se agregó a las muestras de suelo a una concentración celular de 2 × 106 UFC∙kg-suelo-1.

Primero se colocó un escurridor y arena gruesa en el fondo de cada maceta (diámetro de 180 mm; altura de 150 mm), y luego se agregaron a cada maceta 3 kg de tierra contaminada con o sin aislado TF716. En cada maceta se plantaron diez plántulas de festuca alta o cinco plántulas de maíz. El experimento en maceta se realizó por triplicado. Las plántulas altas de festuca se cultivaron a partir de semillas durante 45 días en un jardín en la azotea del Nuevo Edificio de Ingeniería de la Universidad Ewha Womans. Se compraron plántulas de maíz (Mojong 114, Gyeonggi-do, República de Corea) y se cultivaron durante 45 días en el jardín. El experimento con la olla se realizó en la azotea del nuevo edificio de ingeniería de la Universidad de Mujeres Ewha durante 59 días (del 28 de mayo al 26 de julio de 2021). La tierra de la maceta se regó dos veces por semana para mantener un contenido de agua promedio de aproximadamente el 28% durante el período experimental. Durante el experimento en maceta, el pH del suelo osciló entre 6,5 y 7,2 y no hubo diferencias significativas en el pH del suelo entre las condiciones experimentales (datos no mostrados).

Para evaluar el efecto de la inoculación del aislado TF716 sobre el potencial de reducción de N2O del suelo durante la rizorremediación de suelo contaminado con diesel, se tomaron muestras aleatorias de suelo de rizosfera de cada maceta los días 0, 19, 40 y 59. Después del secado al aire a temperatura ambiente, se agregaron 10 g de cada muestra de suelo a una botella de suero de 600 ml que contenía 30 ml del medio mineral. El potencial de reducción de N2O se evaluó de la misma manera que se describió anteriormente13.

Para analizar las concentraciones de diésel residual en el suelo muestreado los días 19 y 59, el suelo recolectado se liofilizó y posteriormente se agregaron 3 g de cada muestra a tubos de ensayo individuales, después de lo cual se agregaron 10 ml de hexano-acetona (1:1). , v/v) se añadió solución como disolvente para la extracción. La concentración de diésel se midió utilizando el mismo método y cromatógrafo de gases (sistema GC 6980 N, Agilent Technologies, CA, EE. UU.) descrito en un estudio anterior13. El día 59, se tomaron muestras de las raíces de la festuca alta y del maíz después de sacudir el suelo de la rizosfera para separar las raíces. Luego las raíces se secaron en estufa a 70 °C durante 72 h y luego se midió el peso seco de las raíces.

Para caracterizar la dinámica de la comunidad bacteriana asociada con la reducción de N2O durante la rizorremediación, se analizó el metagenoma bacteriano en el suelo utilizando conjuntos de cebadores nosZ dirigidos al gen de la N2O reductasa. El ADN genómico de las muestras de suelo secadas al aire se extrajo utilizando un kit de suelo NucleoSpin® (Macherey–Nagel GmbH, Düren, Alemania) y un sistema BeadBeater-8 (BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, EE. UU.) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. instrucciones. Las muestras de ADN genómico se eluyeron en 50 µl de tampón de elución y se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro SpectraMax QuickDrop (Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.). Luego, las muestras de ADN genómico extraídas se almacenaron a -23 °C antes de su uso. La PCR se realizó basándose en un conjunto de cebadores de amplicon-nosZIF (5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGWCSYTGTTCMTCGACAGCCAG-3') y amplicon-nosZIR (5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATGTCGATCARCTGVKCRTTYTC-3')14. Las secuencias subrayadas son preadaptadores, las secuencias en negrita son secuencias de cebadores de secuenciación y las secuencias en cursiva son los cebadores del locus específicos. Los pasos de la PCR se realizaron como se describe en informes anteriores13,14. Las secuencias se analizaron mediante una plataforma de secuenciación Illumina MiSeq (Illumina Inc.) de Macrogen Inc. (Seúl, República de Corea). Las lecturas de secuencia se analizaron utilizando QIIME 1.9 de Macrogen Inc.15. Las secuencias fuera de los pares de bases objetivo se eliminaron utilizando el Ajuste rápido de longitud de lecturas cortas (FLASH) 1.2.1116. Luego se eliminaron las secuencias ambiguas y quiméricas y las secuencias se clasificaron en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud del 97% utilizando el programa CD-HIT-OTU17. La taxonomía para cada OTU se asignó con base en la base de datos microbiana NCBI 16S.

Se empleó Microsoft Excel 2013 (Microsoft Co., Redmond, WA, EE. UU.) para realizar pruebas t y comparaciones múltiples con un valor de P de 0,05 para indicar una diferencia significativa. Las correlaciones de Pearson entre parámetros también se calcularon utilizando R (www.rstudio.com).

La cepa TF716, que se aisló del consorcio reductor de N2O, se identificó como Pseudomonas sp. (Fig. 1), que es la primera rizobacteria reductora de N2O aislada del suelo de la rizosfera de festuca alta. Otras Pseudomonas spp. reductoras de N2O. han sido aislados del suelo18,19, biofiltros para el tratamiento de lixiviados de vertederos20 y plantas de tratamiento de aguas residuales21. Azospira spp. son reductores de N2O que también han sido aislados de procesos de tratamiento de aguas residuales8,19,22. Otras bacterias reductoras de N2O que se han reportado incluyen Bacillus amyloliquefaciens23 y Ralstonia solanacearum24 aisladas del suelo, Paracoccus pantotrophus25 y Alicyliphilus sp.22 aisladas de procesos de tratamiento de aguas residuales, y Aeromicrobium massiliense26 aislada de estiércol fecal humano. Usyskin-Tonne et al.27 también aislaron las bacterias reductoras de N2O Agrobacterium/Rhizobium sp., Alcaligenes sp. y Pseudomonas sp. de raíz de trigo. Lee et al.12 informaron sobre la reducción de N2O por parte del consorcio bacteriano de la rizosfera del maíz y la festuca alta.

Relaciones filogenéticas entre Pseudomonas sp. TF716 y bacterias reductoras de N2O conocidas. Se utilizó un algoritmo de unión de vecinos para construir el árbol. La barra de escala representa 0,1 sustituciones esperadas por sitio.

La Figura 2 presenta la actividad de reducción de N2O del aislado TF716 para diferentes cargas de N2O (200–1500 ppm en el espacio de cabeza). El aislamiento TF716 redujo el N2O sin un período de retraso bajo las cargas experimentales de N2O (Fig. 2a), y la tasa de reducción de N2O aumentó con cargas más altas de N2O hasta 750 ppm (15 µM en líquido) antes de disminuir ligeramente (Fig. 2b). Otros estudios también han informado que la tasa de reducción de N2O aumenta con la concentración de N2O suministrada al aceptor final de electrones8,28. La Figura 2c muestra el gráfico de Lineweaver-Burk utilizando los datos en condiciones proporcionales a la tasa de reducción de N2O y la concentración de N2O (200, 500 y 750 ppm). La tasa máxima de reducción de N2O (Vmax) producida por el aislado TF716 fue de 18,9 mmol N2O g de células secas-1 h-1. En estudios anteriores, la tasa de reducción de N2O para Pseudomonas spp. Se ha informado que es de 2,2 a 2,6 mmol de N2O · g de células secas-1 h-18,19,21, mientras que Azospira spp. exhibió una tasa de reducción de N2O de 1,60 − 23,85 mmol N2O g de células secas −1 h −18,19,22, y la de Alicicliphilus denitrificans fue de 7,6 mmol N2O g de células secas −1 h −122. Teniendo en cuenta estos resultados, la capacidad de reducción de N2O de Pseudomonas sp. TF716 fue superior al de otras bacterias reductoras de N2O excepto Azospira sp. cepa I13 (23,85 mmol N2O g células secas-1 h-1)22.

Efecto de la concentración de N2O sobre la reducción de N2O por Pseudomonas sp. TF716. (a) Perfil temporal de la concentración de N2O con diferentes concentraciones iniciales de N2O. (b) Tasas de reducción de N2O a diferentes concentraciones de N2O. (c) Gráfico de Lineweaver-Burk utilizado para calcular la tasa máxima de reducción específica de N2O (Vmax).

La festuca alta y el maíz se utilizan ampliamente para la rizorremediación de suelos contaminados con petróleo porque sus raíces están bien desarrolladas29,30,31,32. La interacción entre las raíces y las rizobacterias es un parámetro clave para el desempeño de la rizorremediación, y el exudado de las raíces puede afectar positiva o negativamente la actividad de las rizobacterias33,34,35,36,37. Se estudió el efecto de la festuca alta o el exudado de raíz de maíz sobre la reducción de N2O por Pseudomonas sp. TF716 se presenta en la Fig. 3. En comparación con el control (sin exudado radicular), los niveles de N2O se redujeron más rápidamente cuando se aplicó el exudado radicular. Al agregar el exudado de la raíz, la tasa de reducción de N2O para la cepa TF716 aumentó 1,5 veces la tasa de reducción de N2O en el control (9,9 ± 0,3 mmol N2O g de células secas-1 h-1). No hubo diferencias significativas entre los exudados de festuca alta (14,7 ± 0,3 mmol N2O·g células secas-1 h-1) y maíz (14,4 ± 0,8 mmol N2O·g células secas-1 h-1). En estudios previos también se ha informado de una mayor reducción de N2O con la adición de exudado radicular12,38. Por ejemplo, cuando se añadió exudado de raíz a consorcios reductores de N2O, la tasa de reducción de N2O fue entre 1,3 y 2,7 ​​veces mayor que sin el exudado12. El exudado radicular de las plantas contiene diversos compuestos orgánicos como azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos, alcoholes y fosfatos12,39,40,41. Se supone que estos compuestos orgánicos fueron utilizados como nutrientes o factores de promoción del crecimiento para la cepa TF716, lo que condujo a una mayor capacidad de reducción de N2O12,42.

Efecto del exudado radicular (RE) sobre la reducción de N2O por Pseudomonas sp. TF716. (a) Perfil temporal de la concentración de N2O en el medio con o sin RE. (b) Comparación de las tasas relativas de reducción de N2O (sin RE: sin RE; RE_TF: RE de festuca alta; RE_M: RE de maíz). Letras diferentes indican una diferencia significativa en cada parcela (p < 0,05).

La Tabla 1 presenta el efecto de la inoculación del aislado TF716 sobre el potencial de reducción de N2O del suelo contaminado con diesel plantado con festuca alta para rizorremediación. En el suelo sin inoculación, el potencial de reducción de N2O fue de 159,4 ± 6,7 nmol g-suelo seco-1 h-1 el día 0, alcanzando su máximo el día 19 (315, ± 17,4 nmol g-suelo seco-1 h-1). 1), y disminuyó a 279,9 ± 8,6 y 230,6 ± 0,9 nmol g-suelo seco-1 h-1 en los días 40 y 59, respectivamente. Esto podría deberse a que la abundancia relativa de las bacterias implicadas en la reducción de N2O aumentó después de la siembra de la festuca alta. Sin embargo, cuando se agregó el aislado TF716, el potencial de reducción de N2O osciló entre 609,1 ± 32,2 y 760,1 ± 58,9 nmol g-suelo seco −1 h −1 entre los días 0 y 19. En los días 40 y 59, el potencial fue 304,8 ± 5,1 y 260,3 ± 5,8 nmol g-suelo seco −1 h −1, respectivamente, la mitad del valor inicial. Esto indica que la población de la cepa inoculada permaneció dominante en el suelo durante 19 días, pero su abundancia relativa disminuyó posteriormente.

Cuando se añadió el aislado TF716, el potencial de reducción de N2O del suelo fue 2,88 veces mayor que sin inoculación durante el período inicial (0 a 19 días) y de 1,08 a 1,13 veces posteriormente. Estos resultados sugieren que las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel utilizando festuca alta se pueden reducir agregando Pseudomonas sp. TF716. Usyskin-Tonne et al.27 informaron que las emisiones de N2O del suelo de la rizosfera de trigo se pueden reducir mediante la adición de Agrobacterium/Rhizobium spp, mientras que P. stutzeri PCN-1 puede reducir las emisiones de N2O durante el tratamiento de aguas residuales43. En apoyo de esta investigación previa, el presente estudio también demuestra que la adición de bacterias reductoras de N2O es una estrategia prometedora para reducir las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel.

En el suelo plantado con maíz sin aislado TF716, el potencial de reducción de N2O aumentó durante los primeros 40 días de 159,4 ± 6,7 a 239,5 ± 11,3 nmol g-suelo seco-1 h-1, y luego disminuyó a 177,1 ± 1,7 nmol g-suelo seco-1 h-1. -suelo seco−1 h−1 el día 59 (Tabla 1). Este cambio en el potencial de reducción de N2O del maíz fue similar al de la festuca alta. Cuando el suelo con maíz se inoculó con el aislado TF716, el potencial de reducción de N2O del suelo disminuyó con el tiempo de 760,1 ± 58,9 el día 0 a 156,5 ± 2,4 nmol g-suelo seco-1 h-1 el día 59. Así, con la adición del aislado TF716, el potencial de reducción de N2O aumentó 4,8 y 1,3 veces en los días 0 y 19, respectivamente, pero fue ligeramente menor que sin inoculación después de 40 días. Esto indica que la cepa inoculada no mantuvo su dominancia en el suelo sembrado de maíz. Ferrarezi et al.44 investigaron el efecto de la inoculación de rizobacterias sobre el crecimiento del maíz. Dependiendo de la combinación de las rizobacterias inoculadas, se promovió o inhibió el crecimiento del maíz. Por lo tanto, al introducir una rizobacteria, se debe comprender claramente la interacción entre la bacteria y las raíces de la planta para garantizar que se trata de una combinación positiva.

Aunque el aislado TF716 no tiene la capacidad de degradar el diésel por sí solo (datos no mostrados), se evaluó el efecto de su adición al suelo sobre la degradación del diésel porque otros microorganismos del suelo pueden verse afectados por su presencia (Fig. 4). En el suelo plantado con festuca alta, la eficiencia de degradación del diésel en el suelo inoculado no fue significativamente diferente de la del suelo no inoculado, aunque el primero fue ligeramente más rápido que el segundo. En el suelo plantado con maíz, la degradación del diésel en el suelo no inoculado (85 ± 0,8%) fue ligeramente mayor que en el suelo inoculado (80 ± 0,4%) el día 19, pero no hubo diferencia el día 59. En general , la inoculación de TF716 no afectó la degradación del diesel durante la rizorremediación, lo que sugiere que el aislado no inhibe la actividad de los microorganismos involucrados en la degradación del diesel.

Comparación de la eficiencia de eliminación de diésel en los días (a) 19 y (b) 59 durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel (TF: suelo plantado con festuca alta; TF + 716: suelo plantado con festuca alta con la adición de la cepa TF716 ; M: suelo sembrado con maíz; M + 716: suelo sembrado con maíz con la adición de la cepa TF716). Letras diferentes indican una diferencia significativa en cada parcela (p < 0,05).

En general, el crecimiento de las plantas en suelos contaminados se ve inhibido por los contaminantes, pero puede mejorarse con la introducción de rizobacterias. Por ejemplo, el crecimiento de las raíces de las semillas de ricino se promovió con la adición de un consorcio bacteriano en suelos contaminados con Pb y Zn34. La adición de Burkholderia phytofirmans PsJ también redujo la inhibición del crecimiento de raíces y tallos de raigrás en suelos contaminados con diésel45, mientras que la inhibición de manglares en suelos contaminados con diésel se redujo mediante la introducción de Bacillus, Sphingomonas y Rhodococcus46. Además, Gordonia sp. S2RP-17 mejoró el crecimiento del maíz en suelos contaminados con diesel47, y el crecimiento de brotes y raíces de festuca alta en suelos contaminados con PCB aumentó cuando el suelo fue inoculado con Bulkholeria spp.48.

Para investigar el efecto del aislado TF716 en el crecimiento de las plantas, primero se evaluó su capacidad de producción de ácido indol-3-acético (IAA) y su actividad desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), y se descubrió que producía IAA. pero no ACC desaminasa (datos no mostrados). Luego se evaluó el efecto de la inoculación del aislado TF716 sobre el crecimiento de las raíces de festuca alta y maíz (Fig. 5). En comparación con los grupos de control sin inoculación, la adición de la cepa TF716 mejoró ligeramente el crecimiento de las raíces de la festuca alta, aunque esto no fue significativo. En el suelo plantado con maíz, la cepa TF716 tuvo poco efecto sobre el potencial de reducción de N2O y la degradación del diésel (Tabla 1 y Figura 4), pero mejoró inesperadamente el crecimiento de las raíces del maíz. Se requieren más investigaciones para dilucidar el motivo de esto.

Efecto de la inoculación de Pseudomonas sp. TF716 sobre el crecimiento de las raíces de (a) festuca alta y (b) maíz (TF: suelo plantado con festuca alta; TF + 716: suelo plantado con festuca alta con la adición de la cepa TF716; M: suelo plantado con maíz; M + 716: suelo plantado con maíz con la adición de la cepa TF716). En los diagramas de caja, las cajas representan los percentiles 25, 50 y 75, y las barras de error indican los percentiles 5 y 95. Los puntos fuera de los cuadros indican valores atípicos. La línea discontinua indica la mediana. Letras diferentes indican una diferencia significativa en cada parcela (p < 0,05).

La Figura 6 muestra la dinámica de 12 géneros involucrados en la reducción de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diesel. Se ha informado que especies bacterianas pertenecientes a Bradyrhizobium, Aminobacter, Mesorhizobium, Shinella, Paracoccus, Azospirillum, Alcaligenes, Castellaniella y Pseudomonas reducen el N2O 49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. 60,61. Algunos también contienen genes nosZ, que son responsables de la reducción de N2O a N252,54,57,59,62,63,64,65. Se ha informado que Bordetella y Acidovorax son bacterias desnitrificantes con genes nirS y nar/nir, respectivamente66,67,68.

Dinámica de los géneros bacterianos asociados con la reducción de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel. (a) Suelo plantado con festuca alta. (b) Suelo plantado con festuca alta con la adición de la cepa TF716. (c) Suelo sembrado de maíz. (d) Suelo plantado con maíz con la adición de la cepa TF716.

Con base en el análisis de la dinámica de la comunidad bacteriana, los géneros dominantes en los suelos contaminados con diesel fueron Pseudomonas, Bradyrhizobium y Mesorhizobium. Pseudomonas exhibió la abundancia relativa más alta en todas las muestras de suelo, excepto en el suelo plantado con maíz tomado el día 59. En el suelo plantado con festuca alta, la abundancia relativa de Pseudomonas fue de 18,5 a 22,6% durante el período inicial (0-19 d), disminuyendo a 9,0% y 5,0% los días 40 y 59, respectivamente. En el suelo inoculado con TF716 plantado con festuca alta, la abundancia relativa de Pseudomonas aumentó de 75,5 a 95,5% durante los primeros 19 días, pero disminuyó posteriormente a 31,2% el día 59. Sin embargo, en el suelo plantado con maíz, la abundancia relativa de Pseudomonas tendió a disminuir con el tiempo con o sin la presencia de TF716. Dado que Pseudomonas TF716 se aisló de la rizosfera de la festuca alta, se cree que puede crecer mejor en la rizosfera de la festuca alta en comparación con la rizosfera del maíz. Se estima que la abundancia relativa del género Pseudomonas al que pertenece TF716 ha disminuido con el tiempo porque la cepa TF716 inoculada en el suelo compite con los reductores de N2O autóctonos del suelo. En todas las muestras de suelo, la abundancia relativa de Bradyrhizobium y Mesorhizobium aumentó con el tiempo, alcanzando 1,5–2,3% y 1,3–5,3% el día 59, respectivamente. Por el contrario, la abundancia relativa de Parcoccus, Alcaligenes y Catenllaniella disminuyó con el tiempo.

La Figura 7 muestra la correlación entre la inoculación de TF716, el potencial de reducción de N2O del suelo, la eficiencia de eliminación de TPH, el tipo de planta y los géneros bacterianos. El potencial de reducción de N2O se correlacionó positivamente con la adición de TF716 y la abundancia relativa de Pseudomonas (que incluye la cepa TF716). El potencial de reducción de N2O se correlacionó positivamente con la adición del aislado TF716 y la abundancia relativa de Pseudomonas. Pseudomonas se ha utilizado anteriormente como fuente biológica para la rizorremediación de suelos contaminados con TPH69,70,71,72. En particular, la introducción de Pseudomonas, que tiene características que promueven el crecimiento de las plantas, como ACC desaminasa, IAA y producción de sideróforos, mejora el crecimiento de las plantas y, en consecuencia, mejora el rendimiento de la remediación69,70. También se ha informado del efecto positivo de la inoculación de Pseudomonas en la mitigación de las emisiones de N2O en suelos agrícolas61,73. El presente estudio también demuestra que las emisiones de N2O se pueden reducir durante la rizorremediación de suelos contaminados con TPH utilizando Pseudomonas TF716.

Correlación de Pearson entre parámetros clave (N2O: potencial de reducción de N2O del suelo; TPH RE: eficiencia de eliminación de TPH; maíz: plantación de maíz; festuca alta: plantación de festuca alta; TF716: inoculación de Pseudomonas sp. TF716; bacterias a nivel de género: abundancia de géneros bacterianos).

La eficiencia de eliminación de TPH tuvo una estrecha relación con la abundancia relativa de Bradyrhizobium y Mesorhizobium, que se correlacionaron significativamente con el maíz. También tenían una correlación positiva entre sí. Su capacidad de reducción de N2O ha sido demostrada en investigaciones anteriores49,50,51,53,54. Bradyrhizobium puede degradar varios hidrocarburos como cloroalcanos, cloroalquenos y benzonato74, y Mesorhizobium es un conocido degradador de TPH75. Bradyrhizobium y Mesorhizobium también fueron los grupos bacterianos dominantes en los consorcios que degradan n-decano76. Como se muestra en la Fig. 6, la abundancia relativa de Bradyrhizobium y Mesorhizobium aumentó durante el proceso de rizorremediación. Con base en estos resultados, está claro que desempeñan un papel importante en la degradación de los TPH y la reducción de N2O en suelos contaminados con diésel plantados con maíz y festuca alta. Aunque se sabe que Azospirillum promueve el crecimiento del maíz77, en el presente estudio tuvo una correlación positiva con la festuca alta, pero no con el maíz.

También hubo algunas correlaciones significativas entre 12 géneros bacterianos en las muestras de suelo. Pseudomonassp. TF716 tuvo una correlación negativa con la mayoría de los géneros bacterianos. Aminobacter tuvo una relación positiva con Shinella, Azosporillum y Bordetella, mientras que Shinella tuvo una relación positiva con Paracoccus, Azosporillum, Bordetella y Castelaniella. Paracoccus exhibió una alta correlación positiva con Achromobacter, Alcaligenes, Bordetella y Castelaniella. Achromobacter se asoció con Bordetella y Castelaniella, mientras que Alcaligens tuvo una estrecha relación con Bordetella y Castelaniella, y la abundancia relativa de Bordetella se relacionó positivamente con Castelaniella. Se ha informado que Aminobacter degrada la 2,6-diclorobenzamida78,79. Además, se sabe que Shinella, Paracoccus, Azospirillum, Achromobacter, Alcaligenes, Bordetalla, Castenella y Acidovorax descomponen los TPH75,80,81,82,83,84. Aunque no se encontró correlación estadística, se supone que estos grupos bacterianos están involucrados en la degradación del TPH y el metabolismo de los compuestos nitrogenados, incluida la producción y mitigación de N2O.

El N2O es uno de los seis gases de efecto invernadero enumerados en el Protocolo de Kioto y tiene un PCA 298 veces mayor que el del CO2 (IPCC, 2013). Durante la rizorremediación de suelos contaminados con TPH, generalmente se agregan fuentes de nitrógeno para promover el desempeño de la remediación, aumentando así las emisiones de N2O. Para mitigar las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con TPH, se requieren estrategias que reduzcan efectivamente estas emisiones sin afectar negativamente el proceso de degradación de TPH. Pseudomonassp. TF716, aislado de la rizosfera de festuca alta, exhibió una tasa de reducción de N2O de 18,9 mmol N2O · g de células secas −1 h −1, y su actividad de reducción de N2O se mejoró mediante la adición del exudado de raíz de festuca alta. Al introducir Pseudomonas sp. TF716 en suelo contaminado con diésel plantado con festuca alta, el potencial de reducción de N2O del suelo aumentó sin comprometer el proceso de degradación. Durante la rizorremediación durante 59 días, Pseudomonas mantuvo la abundancia relativa más alta en el suelo. Sin embargo, no se observó ninguna mejora en el potencial de reducción de N2O del suelo plantado con maíz cuando Pseudomonas sp. Se añadió TF716, aunque la actividad reductora de N2O de esta bacteria en un medio líquido mejoró con la adición del exudado de raíz de maíz. Estos resultados indican que la adición de Pseudomonas sp. TF716 es una estrategia prometedora para mitigar las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel utilizando festuca alta. Este estudio es el primer informe de que es posible reducir las emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con petróleo mediante la inoculación de una bacteria reductora de N2O. Se requieren estudios de seguimiento para optimizar las condiciones fisicoquímicas para la actividad de Pseudomonas sp. TF716 en el suelo contaminado. Además, se necesitan más estudios sobre la interacción entre las rizobacterias reductoras de N2O y las raíces de las plantas para mitigar con éxito las emisiones de N2O durante el proceso de rizorremediación.

La secuencia del aislado TF716 se depositó en la base de datos NCBI GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el número de acceso MW882239. Las lecturas de secuenciación obtenidas para el análisis de la comunidad bacteriana se depositaron en el NCBI con el número de acceso PRJNA791149.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano a través del Ministerio de Ciencia y TIC (MSIT) (2019R1A2C2006701).

Departamento de Ingeniería y Ciencias Ambientales, Universidad de Mujeres Ewha, Seúl, 03760, República de Corea

Ji Yoon Kim y Kyung Suk Cho

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JYK escribió el manuscrito y KSC lo revisó.

Correspondencia a Kyung-Suk Cho.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kim, JY., Cho, KS. Efecto de la inoculación de Pseudomonas sp. TF716 sobre emisiones de N2O durante la rizorremediación de suelos contaminados con diésel. Informe científico 12, 13018 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17356-z

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Recibido: 04 de abril de 2022

Aceptado: 25 de julio de 2022

Publicado: 29 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17356-z

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Investigación en ciencias ambientales y contaminación (2023)

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