Las membranas intracitoplasmáticas se desarrollan en Geobacter sulfurreducens en condiciones termodinámicamente limitantes

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, número de artículo: 18 (2023) Citar este artículo

2236 Accesos

11 altmétrico

Detalles de métricas

Geobacter sulfurreducens es una bacteria electroactiva capaz de reducir óxidos metálicos en el medio ambiente y electrodos en sistemas de ingeniería1,2. Geobacter sp. son los organismos clave en las biopelículas electrogénicas, ya que su respiración consume productos de fermentación producidos por otros organismos y reduce un aceptor terminal de electrones, por ejemplo, óxido de hierro o un electrodo. Para respirar aceptores de electrones extracelulares con una amplia gama de potenciales redox, G. sulfurreducens tiene una red compleja de proteínas respiratorias, muchas de las cuales están unidas a membranas3,4,5. Hemos identificado estructuras de membrana intracitoplasmática (ICM) en G. sulfurreducens. Este ICM es una invaginación de la membrana interna que se ha plegado y organizado mediante un mecanismo desconocido, a menudo, pero no siempre, ubicado cerca de la punta de una célula. Usando microscopía confocal, podemos identificar que al menos la mitad de las células contienen un ICM cuando se cultivan en superficies de ánodos de bajo potencial, mientras que las células cultivadas en superficies de ánodos de mayor potencial o que usan fumarato como aceptor de electrones tenían una frecuencia de ICM significativamente menor. Los modelos 3D desarrollados a partir de tomografías crioelectrónicas muestran que el ICM es una extensión continua de la membrana interna en contacto con el espacio citoplasmático y periplásmico. La abundancia diferencial de ICM en células cultivadas en diferentes condiciones termodinámicas respalda la hipótesis de que se trata de una adaptación a la disponibilidad limitada de energía, ya que un aumento de las proteínas respiratorias unidas a la membrana podría aumentar el flujo de electrones. Por lo tanto, el ICM proporciona una superficie adicional de la membrana interna para aumentar la abundancia de estas proteínas. G. sulfurreducens es la primera termodesulfobacteria o reductor de óxido metálico que produce ICM.

Si bien clásicamente diferenciamos a los procariotas de los eucariotas por una diferencia en la compartimentación de los orgánulos del citoplasma, la realidad es más complicada. Los procariotas con una diversa variedad de metabolismos y nichos ecológicos expresan varios orgánulos intracelulares bien definidos6,7,8. La mayoría de los orgánulos que se han caracterizado en procariotas se clasifican en una de dos categorías. Los primeros son compartimentos aislados donde se mantienen condiciones especializadas para realizar procesos químicos que no son posibles en el espacio citoplasmático, por ejemplo, el anammoxosoma9, el carboxisoma10 y el acidocalcisoma11. La segunda categoría de orgánulos procarióticos consiste en estructuras de membrana densamente empaquetadas que facilitan un mayor rendimiento de los procesos metabólicos dependientes de la membrana al aumentar el área de superficie disponible en una célula, por ejemplo, el tilacoide, el clorosoma12 y las estructuras membranosas en los oxidantes de metano, nitrito y amoníaco13. 14,15,16. Utilizamos el término general "membrana intracitoplasmática" (ICM) para describir todas estas estructuras lipídicas en procariotas, ya que incluye orgánulos con estructuras membranosas con funciones desconocidas. Para organismos que operan con márgenes termodinámicos delgados o que realizan reacciones químicas lentas, la tasa de actividad enzimática, por ejemplo, la producción de ATP, debe ser proporcional al área de superficie de la membrana disponible para esas enzimas. En algunas bacterias oxidantes de metano, por ejemplo, se han encontrado en el ICM dos enzimas metabólicas esenciales (metano monooxigenasa y metanol deshidrogenasa), que hipotéticamente proporcionan un mayor rendimiento para una reacción potencialmente limitante de la velocidad14,17, y lo mismo se ha observado con el amoníaco. monooxigenasa en bacterias oxidantes de amoníaco15. Curiosamente, la relación entre las proteínas de membrana y los ICM es en ambos sentidos, ya que modificar una bacteria para que sobreexprese una enzima unida a la membrana puede estimular estructuras similares a los ICM en una bacteria que normalmente carece de orgánulos18,19.

Geobacter sulfurreducens es una termodesulfobacteria Gram negativa (anteriormente clasificada como δ-proteobacteria) que reduce el hierro y otros metales en ambientes anaeróbicos1. Como organismo adaptado para respirar óxidos metálicos insolubles en la naturaleza, G. sulfurreducens también es capaz de respirar aceptores de electrones sólidos fabricados por el hombre2. En un sistema diseñado, podemos aprovechar esta transferencia de electrones extracelulares (EET) para producir una corriente eléctrica mensurable. La secuenciación de amplicones de biopelículas electroactivas generalmente encuentra que las especies de Geobacter son el organismo más abundante, independientemente de la fuente del inóculo20. G. sulfurreducens reduce los aceptores de electrones con una amplia gama de potenciales redox estimados21,22 (-0,17 [goethita] a +0,98 V frente a SHE [paladio]), produce una densidad de corriente relativamente alta en sistemas de ingeniería (hasta 10 A ∙ m-2)23, y tiene una red compleja de portadores de electrones5,22,24,25. Para adaptarse a medida que cambia el potencial redox de su aceptor de electrones, G. sulfurreducens expresa al menos tres vías de transferencia de electrones diferentes, cada una de las cuales tiene una condición de crecimiento óptima y una señal electroquímica distinta3,5,22,25. Por estas razones, G. sulfurreducens se considera un organismo electroactivo modelo26.

Las bacterias reductoras de metales como G. sulfurreducens pueden operar en un nicho de energía relativamente limitada. G. sulfurreducens que oxida el acetato y reduce los minerales naturales de hierro (III) puede tener tan solo 0,12 voltios de diferencial redox en el caso de la goetita27, frente a ~1,1 V para la oxidación aeróbica del acetato. En las biopelículas electroactivas, G. sulfurreducens experimenta un gradiente de potencial redox ya que las células en la región exterior de la biopelícula tendrán un potencial efectivo menor debido a la impedancia en la matriz de la biopelícula28. La capacidad de G. sulfurreducens para adaptarse a diferentes condiciones redox depende de una red compleja de portadores de electrones. Este metabolismo flexible depende estrictamente de los procesos de membrana; la cadena de transporte de electrones de la membrana interna en G. sulfurreducens requiere diferentes proteínas transportadoras de electrones que dependen de la cantidad de energía disponible para la célula, es decir, el potencial redox del aceptor de electrones terminal5,22,29,30. Cuando la energía está limitada por aceptores de electrones con potenciales redox bajos, el crecimiento de G. sulfurreducens podría verse limitado tanto por una menor tasa de respiración según la cinética de Nernstian28,31 como por un menor rendimiento de generación de ATP por electrón respirado. El efecto es un metabolismo respiratorio limitado por membrana. Esta limitación da como resultado una disminución del crecimiento y de la tasa respiratoria de G. sulfurreducens que crece en aceptores de electrones de bajo potencial redox29,32.

En este trabajo, hemos descubierto estructuras ICM en G. sulfurreducens. Utilizamos microscopía confocal, microscopía electrónica de transmisión de sección delgada (TEM) incrustada en plástico y tomografía electrónica criogénica (CryoET), para identificar estructuras ICM en G. sulfurreducens que están localizadas en regiones subcelulares específicas. Al observar las células en diferentes condiciones redox, podemos probar la hipótesis de que la ICM en G. sulfurreducens está asociada con condiciones termodinámicas en las que las células deben respirar a bajo potencial. Estas observaciones tienen implicaciones importantes para la comprensión holística de la respiración en condiciones de energía limitada.

En secciones delgadas de plástico preparadas mediante sustitución por congelación de células congeladas por inmersión, observamos estructuras de ICM en células de G. sulfurreducens recolectadas de una biopelícula que se cultivó en un ánodo a -0,07 V frente a SHE. Los ICM aparecen en su mayoría como bandas paralelas de membrana en el citoplasma y se localizan en una fracción del volumen total de la célula (Fig. 1). En algunos casos, los ICM también se observaron como estructuras curvas o circulares. En la mayoría de los casos, cuando la sección TEM mostró la longitud total de la celda, los ICM aparecieron principalmente hacia una de las puntas de la celda (Fig. 1b, d). No encontramos células con ICM en más de un área del citoplasma y no todas las células en nuestras secciones de plástico tenían evidencia de la estructura. Repetimos el procedimiento de corte de plástico con células cultivadas con fumarato, un aceptor de electrones soluble con un potencial redox más alto (E'0 = 0,03 V frente a SHE), y no encontramos evidencia de ICM en las micrografías resultantes (Figura complementaria 1). .

Micrografías TEM incrustadas en plástico sustituido por congelación y congelación de G. sulfurreducens recolectadas de una biopelícula de ánodo preparada a −0,07 V frente a SHE. Las estructuras ICM se presentan como bandas paralelas en un área de una célula. a, c y e muestran ICM en celdas cortadas perpendicularmente al eje mayor, mientras que b, d y f muestran ICM en celdas cortadas paralelamente al eje mayor donde se encuentra el ICM cerca de la punta de la celda. Las micrografías se recogieron en un FEI TF20. Barras de escala: 100 nm.

La TEM convencional incluida en plástico se ha utilizado para caracterizar ICM bacterianos durante más de 50 años33. El ICM de G. sulfurreducens comparte algunas características morfológicas con estructuras descritas previamente en otras bacterias. Las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) pueden producir ICM con una membrana continua doblada firmemente en bandas paralelas localizadas en un área de la célula, aunque el ICM en AOB parece ocupar una fracción mayor del volumen celular en comparación con lo que observamos en G. reductores de azufre33. El MCI en la AOB se forma a partir de la invaginación de la membrana interna33. En AOB Nitrosomonas eutropha, el desarrollo de ICM es estimulado por condiciones de oxidación de amoníaco, pero no se desarrolla ICM durante la desnitrificación anóxica34. De manera similar, observamos la producción de ICM en G. sulfurreducens en respuesta a ciertas condiciones ambientales redox. En G. sulfurreducens aún no hemos determinado el mecanismo de señal que activa la expresión de ICM o si existen proteínas de tipo citoesquelético involucradas en su organización.

Usando CryoET de células enteras, observamos ICM sin los artefactos y daños a la membrana comúnmente introducidos por la deshidratación35. Cultivamos G. sulfurreducens directamente adherido a rejillas TEM con la propia rejilla sirviendo como ánodo en una celda electroquímica seguida de una vitrificación inmediata. Las reconstrucciones de células de G. sulfurreducens muestran ICM que no están tan apretadas y regulares como las que observamos con la sección de plástico TEM (Figs. 2, 3). La diferencia en la apariencia del ICM entre la crioET y la TEM de sección delgada incrustada en plástico podría estar relacionada con artefactos del proceso de deshidratación antes de la incrustación, o debido a una diferencia en la etapa de crecimiento de la biopelícula. CryoET reveló que el ICM en G. sulfurreducens tiene una variación significativa en la morfología. En algunas células, la MCI es una masa poco organizada de estructuras de membrana (Fig. 3), pero en otras es más regular y está compuesta de unidades más pequeñas (Fig. 2). Esta variación puede representar diferentes etapas de desarrollo de la estructura, ya que las muestras de criotomografía se tomaron solo después de 24 h de introducir una rejilla EM en la celda electroquímica, mientras que las imágenes TEM de sección plástica capturan células que se recolectaron de una biopelícula completamente desarrollada. Los ICM, como se observan en los criotomogramas, estaban estrechamente asociados a la membrana interna en la mayoría de los casos y, por lo general, cerca de la punta de la célula (Fig. 2).

a Cortes de tomograma que ilustran cómo se crearon modelos 3D mediante la segmentación por tomograma del ICM ubicado en la punta de una célula de G. sulfurreducens con la membrana interna, la membrana externa, el ICM y varios nanocables modelados a partir del tomograma. La barra de escala es de 100 nm. Modelos 3D b-d de tres celdas separadas que muestran ICM cerca de la punta de cada celda. Estas células se cultivaron a −0,07 V frente a SHE directamente en una rejilla.

Cortes de criotomografía y modelo 3D de una célula de G. sulfurreducens cultivada a –0,17 V frente a SHE en una rejilla crio-EM de oro y carbono perforado como ánodo durante 24 h. La criotomografía muestra cómo la ICM parece formarse por invaginación de la membrana interna. Arriba: cortes de tomografía seleccionados en el eje z que muestran secciones de la invaginación. Abajo: modelo 3D de la membrana interna y la membrana externa a través (abajo a la izquierda) de todo el espesor del volumen modelado y (abajo a la derecha) el modelo cortado aproximadamente por la mitad en el eje z para mostrar el perfil del ICM a una profundidad diferente. Barra de escala: 100 nm.

Los nanocables de proteínas son importantes para la respiración de G. sulfurreducens36,37. Observamos nanocables de proteínas extracelulares en la mayoría de los criotomogramas que recopilamos, pero no está claro si existe una relación directa entre los nanocables y los ICM (Fig. 2, Videos complementarios 1-5). Algunos nanocables cruzan la membrana exterior cerca de las ubicaciones del ICM, pero otros no. Como se espera que el ICM sea un área de alta actividad metabólica, la ubicación de los nanocables para la transferencia de electrones extracelulares podría localizarse preferentemente cerca de esta área.

En una muestra cultivada con un ánodo de menor potencial (−0,17 frente a SHE), podemos observar una supuesta etapa de desarrollo de ICM anterior (Fig. 3). Se muestra claramente que la MCI se forma por invaginación de la membrana interna, lo que es consistente con la formación de MCI en otras bacterias (p. ej., Rhodobacter sphaeroides)38,39. Si bien es evidente una red ICM compleja, una inspección minuciosa muestra que todas las secciones están interconectadas con el espacio citoplasmático dentro de ellas. Por tanto, se trata de una invaginación continua de la membrana interna. Lo más importante es que el espacio periplásmico es continuo y proporciona un camino hacia la membrana externa desde todas las regiones del ICM. Este espacio periplásmico continuo es crucial para el metabolismo de la respiración extracelular de G. sulfurreducens, donde los electrones de la membrana interna deben transportarse extracelularmente, pasando a través de citocromos periplásmicos en el camino40,41. Se ha predicho que G. sulfurreducens tendrá un periplasma más amplio que otras bacterias debido a su proteína Lpp más grande42. Medimos la distancia periplásmica desde la membrana interna a la externa en tomografías de cinco células diferentes de G. sulfurreducens y encontramos una distancia periplásmica de aproximadamente 40 nm (IC del 95 % [38,4, 40,2], n = 128 mediciones, figura complementaria 2), que es mayor que la distancia periplásmica de 30-32 nm encontrada en E. coli en otro estudio42.

También podemos identificar la presencia de ICM en G. sulfurreducens con microscopía confocal. Se ha utilizado una técnica similar para identificar ICM en metanótrofos43. Tomamos imágenes confocales de células de biopelícula fijas de G. sulfurreducens cultivadas a diferentes potenciales anódicos o de suspensiones celulares cultivadas con fumarato como aceptor de electrones, y cada imagen tenía numerosas células individuales (Tabla complementaria 1). El ICM es un área brillante localizada dentro de una célula cuando se tiñe con rojo Nilo, un tinte fluorescente selectivo de lípidos44. Algunas células tienen un solo ICM, mientras que otras tienen múltiples regiones ICM distintas (Fig. 4b). Generalmente, los ICM se encuentran cerca de las puntas de las células, pero también observamos ICM en ubicaciones a lo largo de una célula. Al utilizar el complemento ImageJ MicrobeJ45, podemos detectar los límites de las celdas y los máximos locales dentro de ellos que hemos identificado como ICM. El área del ICM como fracción del área celular total tuvo un valor medio del 5,7 % en la biopelícula de electrodo cultivada a -0,07 V y del 4,2 % en las células de fumarato, pero existe una gran variación en el área fraccional, ya que algunas células tienen más del 30 %. del área ocupada por ICM (Figuras complementarias 3,4). Esto es menor que el área celular ocupada por los ICM en los metanótrofos43. Al aplicar un análisis de imágenes idéntico (recuento de ICM) a células recolectadas en diferentes condiciones, encontramos que un cambio en el aceptor de electrones afecta significativamente la frecuencia de las células de G. sulfurreducens que muestran ICM (Fig. 4a). En biopelículas cultivadas en ánodos a potenciales más altos, observamos una fracción relativamente menor de células con ICM (41 ± 4% a -0,03 V frente a SHE frente a 58 ± 8% a -0,17 V frente a SHE). Las células cultivadas con fumarato tuvieron la incidencia más baja de ICM (14 ± 10%) a pesar de que la pareja redox fumarato/succinato tenía un potencial de alrededor de +0,03 frente a SHE, similar en potencial redox a nuestro potencial de ánodo más alto estudiado. Sin embargo, en una biopelícula habrá un gradiente de potencial redox debido a pérdidas óhmicas y limitaciones de difusión23,46,47, por lo que anticipamos que las células cultivadas con fumarato experimentarán un potencial redox más alto en promedio que las células de biopelícula anódica en un electrodo a una potencial similar. Dado que los potenciales anódicos más bajos proporcionan menos energía potencial para el crecimiento25, la mayor abundancia de ICM puede ser una adaptación a la limitación de energía. Nuestro análisis de imágenes utilizó parámetros conservadores para identificar ICM dentro de las células, por lo que la frecuencia absoluta de ICM probablemente sea mayor.

a Fracción de células con un ICM en G. sulfurreducens en diferentes condiciones de crecimiento. Cada punto representa una imagen única con un promedio de 113 celdas; consulte la Tabla complementaria 1 para conocer los recuentos sin procesar. Los tres potenciales (−0,17, −0,07 y +0,07) representan células recolectadas de ánodos preparados en los potenciales respectivos frente a SHE. Las células en condición de 'fumarato' se cultivaron planctónicamente con fumarato como aceptor de electrones. La prueba estadística consistió en una prueba t de dos colas con corrección de comparación múltiple de Hochberg. *(ρ < 0,05), ***(ρ ≤ 0,001), ****(ρ ≤ 0,0001). b Proyección suma de pilas z confocales de células de G. sulfurreducens cultivadas en un electrodo a -0,07 V frente a SHE con ejemplos de ICM anotados. c Proyección suma de células cultivadas con fumarato como aceptor de electrones que ejemplifica la morfología celular típica cuando el ICM no está presente. Ambas imágenes de células se recortaron a partir de imágenes más grandes tomadas con un aumento de 100X utilizando rojo del Nilo como fluoróforo selectivo de fosfolípidos. Vea los recuadros ampliados en la figura complementaria 5.

G. sulfurreducens tiene un metabolismo respiratorio complejo y eficiente. En la membrana interna, los electrones se trifurcan en diferentes vías de respiración dependiendo del potencial redox del aceptor de electrones terminal3,5,22. Al ser una invaginación de la membrana interna, el ICM debe contener los citocromos de la membrana interna críticos para la respiración. En las bacterias que oxidan el amoníaco y el metano, las enzimas respiratorias limitantes de la velocidad (amoníaco monooxigenasa y metano monooxigenasa, respectivamente) están presentes en el ICM15,17. Para organismos con márgenes termodinámicos reducidos, un ICM podría permitir una mayor tasa de respiración al aumentar la superficie de la membrana y el número total de proteínas respiratorias. La producción de un ICM debe suponer una importante inversión de energía para una célula, y la organización estructural del ICM en G. sulfurreducens sugiere una función especializada fuera del almacenamiento de lípidos. La producción de ICM explica por qué G. sulfurreducens tiene un mayor contenido de lípidos que otras bacterias Gram-negativas48, ya que la producción de ICM en otras bacterias provoca fracciones lipídicas elevadas43,49.

En nuestro estudio encontramos una mayor incidencia de ICM en células que crecen en condiciones termodinámicamente menos favorables (Fig. 4a), consistente con el uso de un ICM para aumentar la frecuencia respiratoria en condiciones limitantes. Un ICM respiratorio en G. sulfurreducens requeriría un mecanismo para pasar electrones al resto de la red de transferencia de electrones extracelular, y si hay una conexión abierta con el periplasma, como se muestra en la Fig. 3, los electrones podrían transferirse por difusión de citocromos periplásmicos. (p. ej., PpcA, GSU1996)40,50. Sin embargo, el transporte de estos citocromos desde las ICM a la membrana externa sería una distancia mucho mayor que el espacio periplásmico típico, ya que las ICM parecen abarcar todo el espesor celular y tienen regiones que están hasta 200 nm de la membrana externa.

Si bien G. sulfurreducens no es la única bacteria con un ICM, no se ha encontrado nada parecido en ningún organismo estrechamente relacionado. Hasta donde sabemos, es el primer organismo del filo Thermodesulfobacteriota identificado para producir un ICM, el primer reductor de óxido metálico que lo hace y la primera documentación de ICM formados en biopelículas. El ICM en G. sulfurreducens brinda una buena oportunidad para estudiar la formación del ICM en general, porque podemos controlar fácilmente su expresión cambiando el potencial redox del aceptor de electrones, y la localización polar del ICM en la punta presenta una oportunidad para estudiar el ICM intracelular. organización en bacterias. La producción variable de ICM en G. sulfurreducens sugiere que esta estructura se forma naturalmente para aumentar la frecuencia respiratoria en condiciones termodinámica y cinéticamente limitantes, una hipótesis que se ha propuesto antes para otros microorganismos8. A diferencia de otras bacterias que producen ICM, G. sulfurreducens no puede completar toda su vía respiratoria dentro del ICM. Los electrones del ICM en G. sulfurreducens deben viajar a la membrana externa para la respiración extracelular, y es posible que esos electrones tengan que viajar micrones a través de una biopelícula antes de llegar al aceptor de electrones terminal.

G. sulfurreducens tiene varios enfoques para optimizar la conservación de energía en condiciones redox limitantes y variables. Tres vías caracterizadas parecen expresarse concomitantemente dentro de una biopelícula electrogénica para maximizar la conservación de energía51. La generación de ICM en condiciones de limitación de energía parece ser una herramienta adicional para maximizar la producción de energía dentro de la célula. Los modelos de Nernstian que se utilizan para predecir las tasas de respiración en G. sulfurreducens predecirían una tasa de respiración lenta a potenciales más bajos28,31,52 La tasa de respiración más lenta es la consecuencia de una proteína de transferencia de electrones que limita la tasa, que se propone estar en la membrana interna28 ,53. Si G. sulfurreducens puede aumentar la cantidad de esta proteína limitante de la frecuencia aumentando la cantidad de membrana interna presente, se alivia la limitación aparente y se pueden lograr tasas respiratorias más altas. Por lo tanto, el conocimiento de cómo se utilizan los ICM y bajo qué condiciones se producen será importante para predecir las tasas de generación de corriente eléctrica por G. sulfurreducens. Los futuros estudios de ICM sobre G. sulfurreducens probablemente aprovecharán las herramientas genéticas que se han desarrollado para el organismo, así como técnicas creativas de imágenes.

G. sulfurreducens PCA (ATCC, Virginia, EE. UU.) se cultivó a partir de reservas de congeladores de glicerol utilizando fumarato o un electrodo como aceptor de electrones25. Las células de fumarato se cultivaron en tubos de cultivo anaeróbicos sellados con medio ATCC 1957 que contenía 1,5 g de NH4Cl, 0,6 g de NaH2PO4, 0,1 g de KCl, 2,5 g de NaHCO3, 0,82 g de acetato de sodio, 8 g de fumarato de sodio y 10 ml de cada solución de vitamina de Wolfe y mineral de Wolfe. por litro de agua que se burbujeó con gas antes de sellar y esterilizar en autoclave. Se usó una mezcla de gases de 80/20% N2/CO2 en todas las condiciones para eliminar el oxígeno del medio y mantener un pH cercano a 7. Las células de electrodo se cultivaron usando el mismo medio sin fumarato en células electroquímicas microbianas de cámara única de 100 ml en 6- Electrodos de grafito de 8 cm2 (Graphitestore, Illinois, EE. UU.) colocados en -0,17, -0,07 o +0,07 V frente a SHE. La corriente eléctrica se controló con un potenciostato VMP3 (BioLogic, Tennessee, EE. UU.). Las botellas del reactor se llenaron con medio, se esterilizaron en autoclave a 121 C y luego se burbujearon con gas para eliminar el oxígeno antes de la inoculación. Cada reactor tenía un electrodo de referencia Ag/AgCl (BASi, Indiana, EE. UU.).

Se fijaron células de G. sulfurreducens de una biopelícula madura (~30 días de crecimiento) en tampón de fosfato que contenía paraformaldehído al 4 %, glutaraldehído al 2 % (v/v) y luego se congelaron en propano líquido antes de la deshidratación mediante sustitución por congelación en tetróxido de osmio al 2 %. disuelto en acetona sobre hielo seco a -80 °C. Las células se devolvieron lentamente a temperatura ambiente para su inclusión en resina Araldite 502 (Ted Pella, Inc.). Estas secciones se cortaron con un espesor de 70 nm y se tiñeron secundariamente con acetato de plomo para mejorar el contraste. Todas las imágenes de sección delgada se realizaron en un Tecnai TF-20 (FEI) o un Phillips CM12.

Para cultivar células de biopelícula de electrodos para crioET, diseñamos un soporte para rejillas TEM de carbono fenestradas para insertarlas en células bioelectroquímicas con cultivos en crecimiento activo. Las rejillas del soporte se sujetan contra una placa de titanio que funciona como ánodo y aceptor de electrones para las bacterias. Se secaron fiduciales de nanopartículas de oro conjugadas con BSA de 6 nm y luego se hornearon a 60 °C para fijar los fiduciales de oro en las rejillas antes de su introducción en el biorreactor. Las rejillas TEM en el soporte se retiraron después de 24 h y se congelaron inmediatamente en etano líquido enfriado con nitrógeno utilizando un congelador de inmersión manual diseñado internamente para capturar las células en su estado activo (Figuras complementarias 6, 7). Para la condición de fumarato, se pipeteó una suspensión de células cultivadas durante 7 a 10 días en cada rejilla, se secó para eliminar el exceso de líquido y se congeló con el FEI Vitrobot Mark IV.

Se tomaron imágenes de las células hidratadas congeladas en un Krios G2 (FEI, Oregón, EE. UU.) con inclinaciones de -65° a +65° en pasos angulares de 2,0° utilizando un esquema de recolección simétrico de dosis54 en regiones donde se podían observar células individuales sobre fenestraciones en el carbón. Las imágenes se recogieron con un aumento nominal de 6500x, dando un tamaño de píxel de 1,8 Å en modo de superresolución en la cámara de cumbre K2 con una tasa de dosis de 0,5 electrones por Å2 * segundo durante tres segundos con una velocidad de fotogramas de 0,2 fotogramas por segundo (total dosis de 100 electrones por Å2). Se corrigió la ganancia de los fotogramas de película individuales, se alinearon con MotionCor255 y las imágenes sumadas se agruparon en 2, lo que dio como resultado una imagen con una escala de 3,6 Å/píxel. Se reapilaron las imágenes sumadas y luego se realizó la reconstrucción tomográfica en eTOMO56. Los cortes de cada tomograma se generaron desde IMOD utilizando la función de guardado de ventana ZAP, que guarda en la resolución nativa del monitor. El modelado 3D se realizó en IMOD y se visualizó en ChimeraX57.

Las células de biopelícula anódica de G. sulfurreducens se resuspendieron, se fijaron y se tomaron imágenes entre 12 y 20 días después de que la corriente comenzara a crecer exponencialmente y fuera de al menos 2 A/m2. Las células de biopelícula de G. sulfurreducens se retiraron del electrodo agitando suavemente en tampón fosfato, se sedimentaron a 4000 xg durante 5 minutos, se resuspendieron en paraformaldehído al 4% durante 1 h, luego se enjuagaron y almacenaron en tampón fosfato a 7 °C. Se tomaron imágenes de células vivas de G. sulfurreducens cultivadas en condiciones de fumarato 5-7 días después de la inoculación. Las células en condiciones tanto de ánodo como de fumarato se diluyeron con tampón fosfato 50 mM para tinción de lípidos con rojo Nilo (ThermoFisher/Invitrogen, rojo, excitación: 561 nm) hasta una concentración final de 2 µg/ml. Las muestras se dejaron incubar durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se tomaron imágenes de las células teñidas en un portaobjetos de vidrio estándar o en un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina al 2% con un cubreobjetos de 1 ½ sellado con esmalte de uñas.

Las imágenes de fluorescencia se adquirieron con un microscopio confocal Nikon C2+ equipado con un objetivo de aceite Plan Apo λ (NA 1,45) 100X utilizando el software NIS Elements adyacente, operado dentro de una caja de guantes anaeróbica. El rojo del Nilo se excitó con un láser de 561 nm y se filtró con un cubo de filtro 525/50 561 LP.

Las pilas Z se procesaron en proyecciones de suma y se aplicó un filtro de desenfoque gaussiano (σ = 1) para suavizar en ImageJ. El complemento ImageJ MicrobeJ45 se utilizó para la detección bacteriana y de ICM de células de G. sulfurreducens en condiciones de ánodo y fumarato con resultados resumidos en la Tabla complementaria 1 y parámetros de análisis en la Figura complementaria 8. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student corregido para comparaciones múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Se puede acceder a los tomogramas utilizados para crear figuras para este manuscrito en el repositorio EMDB-EBI con los números de acceso EMD-27710, EMD-27729, EMD-27748 y EMD-27747.

Caccavo, F. y col. Geobacter sulfurreducens sp. nov., un microorganismo reductor de metales disimilatorios oxidantes de hidrógeno y acetato. Aplica. Reinar. Microbiol. 60, 3752–3759 (1994).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bond, DR & Lovley, DR Producción de electricidad mediante Geobacter sulfurreducens acoplado a electrodos. AEM 69, 1548-1555 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Levar, CE, Chan, CH, Mehta-Kolte, MG y Bond, DR Un citocromo de membrana interna necesario solo para la reducción de aceptores de electrones extracelulares con alto potencial redox. MBio 5, 1–9 (2014).

Artículo de Google Scholar

Zacharoff, L., Chan, CH & Bond, DR La reducción de aceptores de electrones de bajo potencial requiere el citocromo de membrana interna CbcL de Geobacter sulfurreducens. Bioelectroquímica 107, 7-13 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Joshi, K., Chan, CH & Bond, DR El citocromo CbcBA de la membrana interna de Geobacter sulfurreducens controla la transferencia de electrones y el rendimiento del crecimiento cerca del límite energético de la respiración. Mol. Microbiol. 116, 1124-1139 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shively, JM Estructuras intracelulares complejas en procariotas. (Springer Berlín Heidelberg, 2006). https://doi.org/10.1007/11497158.

Chowdhury, C., Sinha, S., Chun, S., Yeates, TO y Bobik, TA Diversos orgánulos de microcompartimentos bacterianos. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78, 438–468 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Greening, C. & Lithgow, T. Formación y función de orgánulos bacterianos. Nat. Rev. Microbiol. 18, 677–689 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Strous, M. y col. Litotrofo desaparecido identificado como nuevo planctomiceto. Naturaleza 400, 446 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shively, JM, Ball, FL & Kline, BW Microscopía electrónica de los carboxisomas (cuerpos poliédricos) de Thiobacillus neapolitanus. J. Bacteriol. 116, 1405-1411 (1973).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seufferheld, M. y col. Identificación de orgánulos en bacterias similares a los acidocalcisomas de eucariotas unicelulares. J. Biol. Química. 278, 29971–29978 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Staehelin, LA, Golecki, JR & Drews, G. ORGANIZACIÓN SUPRAMOLECULAR DE CLOROSOMAS (VESÍCULAS DE CLOROBIO) Y DE SUS SITIOS DE FIJACIÓN A MEMBRANA EN CLOROBIO LIMICOLA. Biochim. Biofísica. Acta 589, 30–45 (1980).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Davies, SL y Whittenbury, R. Estructura fina del metano y otras bacterias que utilizan hidrocarburos. J. Gen. Microbiol. 61, 227–232 (1970).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fassel, TA, Buchholz, LA, Collins, MLP y Remsen, CC Localización de metanol deshidrogenasa en dos cepas de bacterias metilotróficas detectadas mediante marcaje con inmunooro. Aplica. Reinar. Microbiol. 58, 2302–2307 (1992).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiencke, C. & Bock, E. Localización inmunocitoquímica de la monooxigenasa de amoníaco unida a la membrana en células de bacterias oxidantes de amoníaco. Arco. Microbiol. 185, 99-106 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Watson, S. Consideraciones taxonómicas de la familia Nitrobacteraceae Buchanan. En t. J. Sistema. Bacteriol. 21, 254–270 (1971).

Artículo de Google Scholar

Brantner, CA, Remsen, CC, Owen, HA, Buchholz, LA y Collins, M. Localización intracelular de las partículas de metano monooxigenasa y metanol deshidrogenasa en Methylomicrobium album BG8. Arco. Microbiol. 178, 59–64 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

von Meyenburg, K., Jørgensen, BB y van Deurs, B. Efectos fisiológicos y morfológicos de la sobreproducción de ATP sintasa unida a membrana en Escherichia coli K-12. EDUCACIÓN J. 3, 1791–1797 (1984).

Artículo de Google Scholar

Weiner, JH y Lemire, BD Sobreproducción de fumarato reductasa en Escherichia. Microbiología 158, 590–596 (1984).

CAS Google Académico

Yates, MD y cols. Desarrollo convergente de comunidades bacterianas anódicas en pilas de combustible microbianas. ISME J. 6, 2002-2013 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pat-Espadas, AM, Razo-Flores, E., Rangel-Mendez, JR & Cervantes, FJ Reducción de paladio y producción de nanocatalizador por Geobacter sulfurreducens. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 97, 9553–9560 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Levar, CE, Hoffman, CL, Dunshee, AJ, Toner, BM & Bond, DR El potencial redox como variable maestra que controla las vías de reducción de metales por Geobacter sulfurreducens. ISME J. 11, 741–752 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Torres, CICI, Marcus, AK & Rittmann, BE El transporte de protones dentro de la biopelícula limita la generación de corriente eléctrica por parte de las bacterias que respiran ánodos. Biotecnología. Bioeng. 100, 872–881 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bonanni, PS, Schrott, GD & Busalmen, JP Un largo camino hacia el electrodo: ¿cómo transportan sus electrones las células de Geobacter? Bioquímica. Soc. Trans. 40, 1274-1279 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Howley, E., Krajmalnik-Brown, R. & Torres, CI La expresión del gen citocromo cambia en Geobacter sulfurreducens para maximizar la conservación de energía en respuesta a cambios en las condiciones redox. BiorXiv 2022.05.22.492868, 1–34 (2022).

Lovley, DR y cols. Geobacter. Fisiología, ecología y aplicaciones prácticas del Microbe Electric. Avances en fisiología microbiana 59 (Elsevier Ltd., 2011).

Orsetti, S., Laskov, C. y Haderlein, SB Transferencia de electrones entre minerales de hierro y quinonas: estimación del potencial de reducción de la superficie de Fe (II) -goetita a partir de la especiación de AQDS. Reinar. Ciencia. Tecnología. 47, 14161–14168 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Torres, CI et al. Una perspectiva cinética de la transferencia de electrones extracelulares por bacterias que respiran ánodos. Microbiol FEMS. Rev. 34, 3-17 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Levar, CE, Chan, CH, Mehta-kolte, MG y Bond, DR Se requiere un citocromo de membrana interna solo para la reducción de. MBio 5, 02034–14 (2014).

Artículo de Google Scholar

Yoho, RA, Popat, SC y Torres, CI Cambios dinámicos en la vía de transporte de electrones dependientes del potencial en biopelículas anódicas de Geobacter sulfurreducens. ChemSusChem 7, 3413–3419 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kato Marcus, A. et al. Modelado basado en conducción del ánodo de biopelícula de una pila de combustible microbiana. Biotecnología. Bioeng. 98, 1171-1182 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Wei, J., Liang, P., Cao, X. y Huang, X. Una nueva visión de la regulación potencial del crecimiento y la generación de energía de geobacter sulfurreducens en pilas de combustible microbianas desde el punto de vista energético. Reinar. Ciencia. Tecnología. 44, 3187–3191 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Murray, RG & Watson, SW Estructura de Nitrosocystis Oceanus y comparación con Nitrosomonas y Nitrobacter. J. Bacteriol. 89, 1594-1609 (1965).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt, I., Zart, D. & Bock, E. Efectos del NO2 gaseoso en células de Nitrosomonas eutropha previamente incapaces de utilizar amoníaco como fuente de energía. Antonio van. Leeuwenhoek, Internacional. J. General Mol. Microbiol. 79, 39–47 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Bouchet-Marquis, C. & Hoenger, A. Tomografía crioelectrónica en secciones vitrificadas: un análisis crítico de los beneficios y limitaciones de la biología celular estructural. Micron 42, 152-162 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peng, L. y Zhang, Y. El citocromo OmcZ es esencial para la generación de corriente por parte de Geobacter sulfurreducens en condiciones de bajo potencial de electrodo. Electrochim. Acta 228, 447–452 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, F. y col. La estructura de los nanocables microbianos revela hemos apilados que transportan electrones a través de micrómetros. Celda 177, 361–369.e10 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tucker, JD y cols. La invaginación de la membrana en Rhodobacter sphaeroides se inicia en regiones curvas de la membrana citoplasmática y luego forma vesículas esféricas tanto brotadas como completamente desprendidas. Mol. Microbiol 76, 833–847 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Woronowicz, K., Harrold, JW, Kay, JM y Niederman, RA Proteómica estructural y funcional del ensamblaje de membrana intracitoplasmática en Rhodobacter sphaeroides. J. Mol. Microbiol. Biotecnología. 23, 48–62 (2013).

CAS PubMed Google Académico

Lloyd, J.R. y col. Caracterización bioquímica y genética de PpcA, un citocromo periplásmico tipo c en Geobacter sulfurreducens. Bioquímica. J. 369, 153-161 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aklujkar, M. et al. Proteínas involucradas en la transferencia de electrones a óxidos de Fe (III) y Mn (IV) por Geobacter sulfurreducens y Geobacter uraniireducens. Microbiol. (U. Kingd.) 159, 515–535 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Mandela, E. y otros. Adaptación del periplasma para mantener las limitaciones espaciales esenciales para los procesos de la envoltura celular y la viabilidad celular. Elife 11, 1–21 (2022).

Artículo de Google Scholar

Whiddon, KT, Gudneppanavar, R., Hammer, TJ, West, DA y Konopka, MC Análisis basado en fluorescencia de las membranas intracitoplasmáticas de metanótrofos tipo I. Microbio. Biotecnología. 12, 1024-1033 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Greenspan, P., Mayer, EP y Fowler, SD Rojo Nilo: una tinción fluorescente selectiva para gotitas de lípidos intracelulares. J. Biol celular. 100, 965–973 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ducret, A., Quardokus, EM & Brun, YV MicrobeJ, una herramienta para la detección de células bacterianas y el análisis cuantitativo de alto rendimiento. Nat. Microbiol. 1, 1–7 (2016).

Artículo de Google Scholar

Popat, SC & Torres, CI Tasas de transporte críticas que limitan el rendimiento de las tecnologías de electroquímica microbiana. Biorrecurso. Tecnología. 215, 265–273 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bond, DR, Strycharz-Glaven, SM, Tender, LM & Torres, ICI Sobre el transporte de electrones a través de biopelículas de Geobacter. ChemSusChem 5, 1099–1105 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Howley, E., Ki, D., Krajmalnik-brown, R. & Torres, CI El metabolismo único de Geobacter sulfurreducens da como resultado células con un alto contenido de hierro y lípidos. Microbiol. Espectro. 2, 1–6 (2022).

Google Académico

Patt, TE & Hanson, RS Contenido de membrana intracitoplasmática, fosfolípidos y esteroles de células de Mmethylobacterium organophilum cultivadas en diferentes condiciones. J. Bacteriol. 134, 636–644 (1978).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pokkuluri, PR et al. La estructura de un nuevo citocromo c dodecahemo de Geobacter sulfurreducens revela una proteína extendida de 12 nm con hemo que interactúan. J. Estructura. Biol. 174, 223–233 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

He, X., Chadwick, G., Jiménez Otero, F., Orphan, V. & Meile, C. Transporte de electrones resuelto espacialmente a través de biopelículas de Geobacter sulfurreducens que respiran ánodos: controles y restricciones. ChemElectroChem 1–13 (2021) https://doi.org/10.1002/celc.202100111.

Richter, H. y col. La voltamperometría cíclica de biopelículas de Geobacter sulfurreducens de tipo salvaje y mutante en ánodos de pilas de combustible indica posibles funciones de OmcB, OmcZ, pili tipo IV y protones en la transferencia de electrones extracelulares. Entorno energético. Ciencia. 2, 506–516 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Lusk, BG y cols. La dependencia del PH en las biopelículas anódicas de Thermincola ferriacetica sugiere una respuesta electroquímica dependiente de protones. Mermelada. Química. Soc. 140, 5527–5534 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hagen, WJH, Wan, W. & Briggs, JAG Implementación de un esquema de inclinación de tomografía crioelectrónica optimizado para promediar subtomogramas de alta resolución. J. Estructura. Biol. 197, 191-198 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ y cols. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por el haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mastronarde, DN & Held, SR Alineación automatizada de series de inclinación y reconstrucción tomográfica en IMOD. J. Estructura. Biol. 197, 102-113 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Pettersen, EF y cols. UCSF ChimeraX: visualización de estructuras para investigadores, educadores y desarrolladores. Ciencia de las proteínas. 30, 70–82 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

La financiación para este trabajo fue proporcionada por la Oficina de Investigación Naval (premio ONR N0014-20-1-2269). La microscopía confocal se realizó en una Nikon C2+ obtenida a través de una subvención ONR DURIP N00014-19-1-2531. Toda la microscopía electrónica se realizó en las instalaciones centrales de microscopía electrónica de ASU. La manipulación del modelo 3D se realizó parcialmente con UCSF ChimeraX, desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud R01-GM129325 y la Oficina de Infraestructura Cibernética y Biología Computacional. Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.

Escuela de Ingeniería Sostenible y Medio Ambiente Construido, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Ethan Howley

Escuela de Ingeniería de Transporte Masivo y Energía, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Anna Mangus y César I. Torres

Centro de Materiales Eyring, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

David Williams

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

EH planificó y realizó experimentos, creó figuras, escribió el primer borrador del manuscrito y lo editó; AM planificó y realizó la microscopía confocal; DW realizó criotomografía; CT obtuvo financiación, planificó el estudio y editó el manuscrito.

Correspondence to César I. Torres.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Howley, E., Mangus, A., Williams, D. et al. Las membranas intracitoplasmáticas se desarrollan en Geobacter sulfurreducens en condiciones termodinámicamente limitantes. npj Biofilms Microbiomas 9, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

Descargar cita

Recibido: 05 de octubre de 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 07 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt