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npj Biofilms and Microbiomes volumen 8, número de artículo: 70 (2022) Citar este artículo

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Los microbiomas abundan para la explotación biotecnológica, particularmente el microbioma ruminal, debido a su complejidad y diversidad. En este estudio, se evaluó el potencial terapéutico de péptidos antimicrobianos (AMP) del microbioma ruminal (Lynronne 1, 2, 3 y P15) contra siete cepas clínicas de Pseudomonas aeruginosa. Todos los AMP exhibieron actividad antimicrobiana contra todas las cepas, con concentraciones inhibidoras mínimas (CMI) que oscilaron entre 4 y 512 µg/ml. La cinética de eliminación temporal de todos los AMP con valores de MIC de 3 × contra las cepas PAO1 y LES431 mostró una eliminación completa dentro de 10 minutos a 4 h, aunque P15 no fue bactericida contra PAO1. Todos los AMP inhibieron significativamente la formación de biopelículas por las cepas PAO1 y LES431, y los ensayos de inducción de resistencia no mostraron ninguna disminución en la actividad contra estas cepas. La citotoxicidad del AMP contra las células pulmonares humanas también fue mínima. En términos de mecanismo de acción, los AMP mostraron afinidad hacia los lípidos de la membrana bacteriana PAO1 y LES431, permeabilizando eficientemente la membrana de P. aeruginosa. El análisis del transcriptoma y del metaboloma reveló una mayor actividad catalítica en la membrana celular y la promoción de la β-oxidación de los ácidos grasos. Finalmente, las pruebas realizadas con el modelo de infección de Galleria mellonella mostraron que Lynronne 1 y 2 eran eficaces in vivo, con una tasa de supervivencia del 100% después del tratamiento con 32 mg/kg y 128 mg/kg, respectivamente. Este estudio ilustra el potencial terapéutico de los AMP derivados del microbioma contra las infecciones por P. aeruginosa.

Los microbiomas ofrecen un recurso en gran medida sin explotar de nuevos bioactivos para la explotación biotecnológica debido a su complejidad y diversidad. El rumen es un excelente ejemplo en el que bacterias, hongos, protozoos y fagos interactúan simbióticamente para recolectar energía del alimento ingerido1. Sin embargo, como la mayoría de los microbiomas, los microbios del rumen muestran un comportamiento competitivo cuando las condiciones requieren resiliencia para sobrevivir. Recientemente se ha demostrado la producción de nuevos antimicrobianos por parte de los microbios del rumen, y estos bien pueden ayudar a la destreza competitiva2,3,4,5,6. Muchos de estos antimicrobianos están clasificados como péptidos antimicrobianos (AMP) y también se ha demostrado que son eficaces contra una variedad de bacterias patógenas, lo que ilustra su posible aplicación médica junto con su papel en el mantenimiento de la función del microbioma ruminal2,3. De hecho, una revisión realizada por O'Neill en 2016 describió seis posibles estrategias que requieren investigación para tratar infecciones bacterianas multirresistentes, que incluían AMP7.

Los AMP son normalmente catiónicos y constituyen un grupo estructuralmente diverso de moléculas, compuestos por secuencias peptídicas cortas, que son eficaces contra bacterias potencialmente patógenas, al tiempo que son capaces de modular las defensas innatas y el proceso inflamatorio8. Hay un número creciente de AMP con un amplio espectro de actividad biológica, lo que resulta muy prometedor para posibles aplicaciones biomédicas, ya que pueden regular reacciones proinflamatorias, estimular la proliferación celular, promover la cicatrización de heridas modulando la migración celular y más9. Sus mecanismos antimicrobianos son únicos y, cuando se utilizan en combinación con antibióticos tradicionales, los AMP catiónicos pueden ampliar su espectro y sus efectos terapéuticos10. Los AMP catiónicos están presentes de forma natural en una amplia variedad de organismos y constituyen un componente importante del sistema inmunológico innato11 y se descubren continuamente y, si se desarrollan estratégicamente, podrían avanzar en el tratamiento de infecciones resistentes a los medicamentos.

De hecho, el desarrollo estratégico de nuevos antimicrobianos nunca ha sido tan importante ya que la resistencia a múltiples medicamentos (MDR) está aumentando y, en consecuencia, disminuye nuestra capacidad para tratar infecciones bacterianas MDR. La Organización Mundial de la Salud (OMS) predice que para 2050 las muertes asociadas con las bacterias MDR aumentarán. ser mayor que las muertes por cáncer. La OMS también ha identificado los patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, especies de Enterobacter) como los más preocupantes, ya que muestran una gran MDR y son responsables de la mayoría de las infecciones nosocomiales y de heridas en todo el mundo12. Los patógenos ESKAPE poseen una variedad de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos, incluida la inactivación enzimática, la formación de biopelículas, el cambio de la permeabilidad celular y la modificación de los objetivos de los fármacos13. De hecho, las biopelículas microbianas pueden hacer que muchos tratamientos con antibióticos y componentes del sistema inmunológico del huésped sean ineficaces14. Además, se ha implicado que la formación de biopelículas complejas por P. aeruginosa es un factor importante que contribuye al retraso en la cicatrización de heridas crónicas15 y durante más de 40 años, la infección crónica por P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística se ha considerado una infección orientada a biopelículas14. En consecuencia, hay muy pocos antibióticos nuevos disponibles para tratar las infecciones por P. aeruginosa y el desarrollo de nuevas estrategias para combatir las infecciones por biopelículas es de suma importancia para reducir los considerables costos de atención médica y la morbilidad de los pacientes16.

En este estudio, determinamos la eficacia in vitro e in vivo de cuatro AMP derivados del microbioma ruminal Lynronne 1 (19 AA: LPRRNRWSKIWKKVVTVFS-NH2), Lynronne 2 (20 AA: HLRRINKLLTRIGLYRHAFG-NH2), Lynronne 3 (20 AA: NRFTARFRRTPWRLCLQFRQ- NH2) y P15 (20 AA: KFVRLKIYCRDKNKGRGISF-NH2) contra cepas de P. aeruginosa utilizando tecnologías bioquímicas y ómicas. Oyama et al. Prospeccionaron el metagenoma del rumen mediante cribado funcional y otros enfoques computacionales para identificar posibles candidatos a péptidos antimicrobianos para aplicaciones terapéuticas2. En ese estudio, se caracterizaron Lynronne 1–3 y P15 y se descubrió que eran eficaces contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y otros patógenos bacterianos clínicamente relevantes, incluidas las cepas de P. aeruginosa2. Las actividades de Lynronne 1–3 contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se caracterizaron ampliamente, mientras que en el estudio de Oyama et al.2 solo se realizó la susceptibilidad antimicrobiana de los patógenos a los P15. El modelado estructural mostró que Lynronne 1–3 adopta una conformación de hélice α de naturaleza anfipática, con una carga positiva neta y una relación de hidrofobicidad de ≥40%2. En este estudio, caracterizamos la estructura 3D de los P15. También investigamos el mecanismo de acción de los cuatro AMP, Lynronne 1–3 y P15 contra cepas clínicas de P. aeruginosa. Ya se encuentran disponibles algunos datos preclínicos para la aplicación tópica de Lynronne 1-3 a un modelo de ratón de infección de heridas por MRSA; sin embargo, aquí se investigó la eficacia en un modelo de infección de Galleria mellonella PAO1. Este estudio proporciona los datos preclínicos fundamentales necesarios para determinar la viabilidad de estos AMP como futuras terapias alternativas.

En el estudio fundamental de Oyama et al.2 se identificó y caracterizó una gran cantidad de nuevos AMP del metagenoma del rumen. En ese estudio, Lynronne 1, Lynronne 2 y Lynronne 3 demostraron ser eficaces contra numerosos patógenos bacterianos, sobre todo contra MRSA. Para este estudio, la susceptibilidad de los aislados clínicos de P. aeruginosa resistentes a múltiples fármacos a Lynronne 1, 2, 3 y los P15 menos caracterizados se muestra como datos de concentración inhibidora mínima (MIC) y concentración bactericida mínima (MBC) en la Tabla 1. Estos Se seleccionaron cepas de P. aeruginosa por sus diversos perfiles de RAM y ubicaciones geográficas; en la Tabla 1 se muestran metadatos adicionales para las cepas. Todos los péptidos fueron activos contra las cepas gramnegativas analizadas, siendo Lynronne 1 la que tuvo la mayor actividad y la CIM más baja. en todas las cepas, desde 4 μg/mL para el aislado C3719 hasta 64 μg/mL para el aislado AES-1R. Las CMI de Lynronne 2 estuvieron entre 8 y 64 μg/mL, mientras que Lynronne 3 y P15 fueron las menos activas en todos los aislados con rangos de CIM entre 32 y 256 y 32 y 512 μg/mL, respectivamente. La cepa LES400 fue la menos susceptible al antibiótico de control levofloxacina (CMI = 1 μg/ml), pero fue la más susceptible a los AMP, y los cuatro AMP tenían una CMI de 16 o 32 μg/ml. Las cepas AMT0060-2, AES-1R y NH57388A fueron las menos susceptibles a los AMP (CMI = 32–512 μg/ml).

Los valores de MBC posteriores se determinaron mediante la presencia de bacterias viables después de una incubación de 24 h en agar Muller Hinton (Tabla 1). La determinación de MBC confirmó que la inhibición del crecimiento bacteriano de los AMP corresponde a un efecto bactericida, y los valores de MBC se mantuvieron en MIC o como máximo dos veces más altos que la MIC.

Oyama et al.2 encontraron que Lynronne 1–3 tenía una carga neta positiva de +6, +5 y +6, respectivamente, con una relación de hidrofobicidad de ≥40%, mientras que P15s tiene carga positiva (+6) con una relación de hidrofobicidad. del 35% y una relación arginina-lisina (R + K) del 35% (Fig. 1a). Se ha demostrado que Lynronne 1–3 adopta conformaciones de hélice α2. Un análisis estructural más detallado de Lynronne 1, incluida la espectroscopia de RMN en solución, confirmó una hélice anfipática de 13 residuos que contiene los seis residuos catiónicos, asociada positivamente con una mayor selectividad peptídica17. El modelado estructural utilizando PEP-FOLD reveló una estructura de giro de hoja β antiparalela para P15, que es distinta de las conformaciones helicoidales α adoptadas por Lynronne 1–3 (Fig. 1a).

a Estructura prevista para el péptido 15: cadena principal y cadenas laterales representadas en representación de cinta y barra, respectivamente, y coloreadas según el tipo de átomo: carbono, oxígeno y nitrógeno en verde, rojo y azul, respectivamente. Figura renderizada usando PyMol. b Muerte dependiente del tiempo de las cepas de P. aeruginosa PAO1 y (c) LES431 por los AMP Lynronne 1, 2 y P15 a una concentración de MIC 3x. d Actividad y eficacia del establecimiento de antibiopelículas de AMP contra biopelículas establecidas durante 24 h de la cepa PAO1 de Pseudomonas y (e) LES431 con Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 mostrados como porcentaje de reducción de biopelículas (OD570 nm) de los no tratados (control de crecimiento), significancia calculada utilizando ANOVA de un solo factor. Para los paneles b-e, los valores provienen de tres réplicas independientes y las barras de error representan la desviación estándar (cuando no son visibles, esto se debe a la falta de variabilidad).

Procedimos a caracterizar aún más la actividad bactericida de Lynronne 1, 2 y P15 contra dos aislados, las cepas de P. aeruginosa PAO1 y LES431 junto con levofloxacina y polimixina B. Estas dos cepas clínicas se seleccionaron por su frecuencia de mención en la literatura y sus diferentes CMI. Valores /MBC. Lynronne 3 no se caracterizó más debido a las MIC y MBC más altas obtenidas. Los ensayos de cinética de destrucción se realizaron utilizando el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la exposición de las bacterias a 3X MIC de los AMP en caldo Mueller Hinton ajustado con cationes. Las concentraciones de antimicrobianos para los ensayos de eliminación del tiempo in vitro varían en la literatura; en este estudio se eligió 3X MIC para alinearse con los datos de AMP publicados anteriormente2. Los datos mostraron una rápida eliminación dependiente del tiempo de ambas cepas por parte de Lynronne 1 y 2 con una reducción de ≥3 log UFC/ml dentro de las primeras 2 h para PAO1 (Fig. 1b) y en la primera hora (exposición <10 min) para LES431. (Figura 1c). Los P15, por otro lado, no mostraron ningún efecto bactericida contra PAO1 durante el tiempo del ensayo, mientras que mostraron un fuerte efecto letal (reducción >8 Log UFC/mL) contra la cepa LES431. Surgieron patrones similares: Lynronne 1 y 2 mostraron reducciones relativamente más lentas en UFC/mL frente a PAO1 en comparación con LES431. Levofloxacino tuvo la actividad bactericida esperada contra PAO1 y LES431 con una reducción ≥3 log UFC/mL en el recuento de células18. Sin embargo, en comparación con Lynronne 1 y 2, la levofloxacina tardó aproximadamente tres veces más en mostrar una reducción similar en UFC/mL. La polimixina B mostró una reducción >8 Log CFU/mL contra PAO1 pero no pudo reducir el Log CFU/mL de LES431 en el límite de tiempo del ensayo.

Se investigó la capacidad de Lynronne 1, 2 y P15 para inhibir/prevenir la formación de biopelículas PAO1 y LES431 de P. aeruginosa y su actividad contra biopelículas establecidas (24 h). Para este ensayo, utilizamos un modelo de biopelícula en placa de 96 pocillos2. A una concentración de MIC 3 ×, los AMP fueron capaces de disminuir significativamente PAO1 (ANOVA unidireccional, P = 2.33E-26) (Fig. 1d) y LES431 (ANOVA unidireccional, P = 6.37E-24) (Fig. 1e) unión de biopelícula. A una concentración de 3X MIC, todos los péptidos no mostraron actividad anti-biopelícula significativa contra biopelículas establecidas (24 h) de P. aeruginosa PAO1 y LES431 (Fig. 1d, e).

La resistencia a los AMP catiónicos es un fenómeno emergente y compromete su eficacia como potenciales agentes terapéuticos19. Para identificar candidatos terapéuticos prometedores a AMP, se deben evaluar los mecanismos de resistencia para determinar si el patógeno objetivo ya ha adquirido mutaciones específicas o genes de resistencia20. No se obtuvieron mutantes resistentes de las cepas PAO1 y LES431 de P. aeruginosa después de pases en serie de cultivos en presencia de concentraciones sub-CMI de Lynronne 1, 2 y P15 durante un período de 25 días (se muestran todos los valores de CIM de los ensayos de pases en serie). en la Tabla complementaria 1). Estos resultados complementan los hallazgos de Oyama et al., que no mostraron selección de mutantes resistentes por parte de Lynronne AMP en varios patógenos, incluido Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)2.

En Oyama et al., se probó la citotoxicidad de Lynronne 1–3 para células HUVEC y HepG2 de mamíferos con una citotoxicidad relativamente baja2. En este estudio, se evaluó la citotoxicidad de los AMP contra células pulmonares fibroblásticas (células IMR90) (Fig. 2a) y células epiteliales humanas (BEAS-2B) (Fig. 2b), células adicionales representativas de posibles sitios de infección por P. aeruginosa. En concentraciones de hasta 1 mg/ml, las células tratadas con P15 permanecieron por encima del 50 % de viabilidad en ambas líneas celulares. Los valores de CI50 (es decir, la concentración de péptido que da como resultado una disminución del 50%) sobre la viabilidad celular para los AMP Lynronne 1, 2 y P15 son los siguientes (Tabla 2); 138,9 ± 34,18, 1177 ± 309,2 y 3337 ± 882,3 µg/ml para células BEAS y 94,23 ± 21,74, 803,2 ± 202,8 y 948,9 ± 224 µg/ml para células IMR90, respectivamente. Por lo tanto, los datos de citotoxicidad mostraron que P15 era el menos citotóxico en comparación con Lynronne 1 y 2. Además, la línea de células epiteliales (BEAS-2B) era menos susceptible a todos los AMP en comparación con las células de fibroblastos (IMR90).

a Citotoxicidad de Lynronne 1, 2 y P15 contra células pulmonares humanas IMR90 (fibroblastos bronquiales humanos). b Citotoxicidad de Lynronne 1, 2 y P15 contra BEAS-2B (células epiteliales del pulmón humano). En todos los casos, los valores provienen de tres réplicas independientes; los resultados se expresan como medias ± desviación estándar. c Actividad de permeabilización de la membrana de AMP a 4 × MIC frente a PAO1 medida mediante el método de yoduro de propidio a lo largo del tiempo (d) Actividad de permeabilización de la membrana de AMP a 4 × MIC frente a LES431 medida mediante el método de yoduro de propidio a lo largo del tiempo. En ambos casos, los valores provienen de tres réplicas independientes; los resultados se expresan como medias ± desviación estándar (cuando no son visibles, esto se debe a la falta de variabilidad).

Anteriormente, se demostró que Lynronne 1 y 2 eran capaces de permeabilizar la membrana celular MRSA USA3002. En este estudio, todos los AMP (Lynronne 1, 2 y P15) con valores de MIC de 4 × fueron capaces de permeabilizar las membranas celulares PAO1 (Fig. 2c) y LES431 (Fig. 2d) dentro de los primeros 20 minutos de exposición, lo que sugiere una alteración de la membrana. mecanismo de acción. Lynronne 1 y 2 mostraron capacidades de permeabilización de la membrana bacteriana relativamente más rápidas, con una permeabilización del 49% al 82% (PAO1) y del 66% al 96% (LES431) observada después de 5 minutos. Por el contrario, aunque son membranolíticos, los P15 actúan relativamente más lentamente con solo un 16% (PAO1) de permeabilización a los 5 minutos, alcanzando un efecto máximo equivalente a los otros AMP (81% de permeabilización) después de 40 minutos de exposición.

El cálculo del índice terapéutico (TI) para cada uno de los péptidos derivados del microbioma (Tabla 2) reveló que Lynronne 2 y P15 tienen un TI significativamente más alto (tanto TI medio como rango de TI) que Lynronne 1 que tenía el TI más bajo del grupo. AMP probados, lo que indica que la relación entre citotoxicidad y actividad antimicrobiana puede no ser óptima.

Usando TEM, observamos cambios en la morfología de las células bacterianas PAO1 después del tratamiento con Lynronne 1 y P15 (Fig. 3). Debido a la actividad inhibidora y bactericida similar de Lynronne 1 y 2, solo se eligieron Lynronne 1 y P15 para este ensayo, ya que planteamos la hipótesis de que estos AMP podrían tener la diferencia más cualitativa en el mecanismo de acción. Después de 1 h de tratamiento con Lynronne 1, la morfología de las células PAO1 se vio afectada y las micrografías muestran una posible alteración de la membrana celular con fuga citoplasmática (Fig. 3b). Después del tratamiento durante 1 h con P15 (Fig. 3c), es más difícil distinguir diferencias morfológicas en comparación con los no tratados, ya que la membrana externa aún está intacta (Fig. 3a), lo que indica un posible contraste en la actividad con Lynronne 1. Además En el suplemento se muestran ejemplos (Figura 7 complementaria).

a Células PAO1 no tratadas (b) Células PAO1 tratadas con Lynronne 1 (3 × MIC durante 1 h) (c) Células PAO1 tratadas con P15s (3 × MIC durante 1 h). En las micrografías se muestran barras de escala de 500 nm.

La interacción de los AMP con los lípidos de la membrana se evaluó midiendo la presión crítica de inserción utilizando un sistema de monocapa lipídica (balanza de Langmuir)2. Se midió la interacción de los péptidos con extractos de lípidos de las cepas objetivo de P. aeruginosa PAO1 y LES431 (Fig. 4a, c, e). Se usaron lípidos puros para determinar si los péptidos eran selectivos, y también se midieron los lípidos presentes en la membrana externa de la bacteria o en las membranas eucariotas, como fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE) (Fig. .4b, d, f).

Mediciones de monocapa lipídica para la interacción de Lynronne 1, 2 y P15 con extractos de lípidos totales o lípidos puros, una interacción de Lynronne 1 con extractos de lípidos LES431 y PA01, b interacción de Lynronne 1 con lípidos puros, c interacción de Lynronne 2 con LES431 y Extractos de lípidos PA01, d interacción de Lynronne 2 con lípidos puros, e interacción de P15 con extractos de lípidos LES431 y PA01, f interacción de P15 con lípidos puros. PC 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina, PG 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol), PE 1-palmitoil-2-oleoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina, Cardio Cardiolipina.

Al evaluar las interacciones de la monocapa lipídica de AMP con PAO1 y LES431, Lynronne 2 fue la más eficaz y mostró afinidad por los extractos lipídicos bacterianos. A pesar de una menor citotoxicidad para las líneas celulares de mamíferos BEAS-2B e IMR90, las P15 mostraron afinidad por la PC (el lípido medio de la lámina externa de la membrana celular humana) en estudios de interacción de monocapa lipídica de AMP. A pesar de la rápida eliminación de LES431 por parte de P15 demostrada en la cinética de eliminación del tiempo, el péptido tuvo una presión crítica de inserción más baja cuando se probó contra extractos de lípidos puros de LES431. Los P15 mostraron una presión crítica de inserción más alta contra los extractos de lípidos puros PAO1, pero una reducción considerablemente más lenta en UFC/ml en la cinética de eliminación del tiempo, lo que indica que el mecanismo de acción contra PAO1 y LES431 probablemente sea distinto.

Todos los AMP interactuaron con los lípidos con selectividad variada (Tabla 3). Lynronne 1 y P15 interactuaron preferentemente con lípidos puros de la valva externa de la membrana bacteriana, es decir, cardiolipina, PG, y en menor medida con los lípidos puros de la valva externa de la membrana celular eucariota, es decir, PC, PE, dando resultados similares. afinidad (Fig. 4b, f). Lynronne 2 también interactuó con PG, Cardiolipina y PE, pero se insertó con mayor fuerza en PC (Fig. 4d). Interacciones más fuertes con PC podrían indicar posibles propiedades hemolíticas de Lynronne 1 y 2, ya que este lípido puro se utiliza para imitar la interacción con la membrana citoplasmática de las células de mamíferos21.

Ambas cepas de P. aeruginosa PAO1 y LES431 se sometieron a tratamiento con Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 para comprender mejor el efecto a nivel de transcriptoma de los péptidos en comparación con las células no tratadas. Se eligió el tratamiento con AMP a una concentración de MIC durante 60 minutos para garantizar un rendimiento y una calidad de ARN suficientes a partir de células viables. A partir de este ensayo, se secuenciaron 24 muestras (tres réplicas para cada tratamiento y sin tratar, para PAO1 y LES431 tomadas en 1 h), lo que produjo ~26 millones de lecturas para PAO1 y ~31 millones de lecturas para LES431 (36,54 GB de datos combinados) con un promedio lea la longitud antes de recortar de 126 para ambas cepas. Luego, estas secuencias se asignaron a los genomas de referencia (NCBI: txid208964 para PAO1 y txid1408272 para LES431). Se realizaron análisis de componentes principales (PCA) y análisis de agrupamiento jerárquico (HCA) con análisis de varianza unidireccional (ANOVA) sobre las lecturas alineadas para mostrar los efectos de control versus tratamiento en PAO1 y LES431 (Figura complementaria 1). La separación entre los grupos tratados y de control fue evidente para ambas cepas en los gráficos de PCA, pero fue aún más pronunciada en las figuras del Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (Fig. 5a, b). El análisis de expresión diferencial identificó los 20 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de las principales variables para cada cepa y se resume en un mapa de calor que muestra los genes regulados hacia arriba o hacia abajo más significativamente en todos los grupos de tratamiento, etiquetados con designaciones de genes (NCBI) para PAO1 (Fig. 5a). Debido a la mala caracterización de LES431, los 20 DEG de variables superiores están etiquetados con etiquetas de locus que muestran los nombres de los productos de proteínas de la base de datos del genoma de Pseudomonas para facilitar la interpretación (Fig. 5b). Las comparaciones entre los tratamientos con péptidos individuales para ambas cepas se muestran en los gráficos de volcanes (Figura complementaria 2). Para PAO1, el análisis de enriquecimiento GO de las 20 DEG variables principales mostró que el 75% de los genes mapeados estaban asociados con la actividad catalítica (GO:0003824) y el 25% de los genes mapeados estaban involucrados en la actividad del transportador (GO:0005215) (Figura complementaria .3). El análisis de enriquecimiento GO de los 40 genes variables principales (Figura 6 complementaria) mostró una expresión significativamente reducida de arcA, arcB y arcC en presencia de Lynronne 1 y Lynronne 2, genes de operones de arco asociados con el metabolismo de la arginina y la vía de la arginina deiminasa (ADI). 22. La alteración del metabolismo de la arginina sugiere que Lynronne 1 y 2 han reducido la capacidad protectora de PAO1 para ajustar el pH citoplasmático en respuesta a cambios extracelulares hostiles en la acidez. Para los P15, el metabolismo de la arginina se vio menos afectado; sin embargo, la expresión del antiportador de arginina-ornitina (arcD) responsable del intercambio de transporte de ornitina y arginina en la membrana bacteriana se reguló significativamente a la baja. Los AMP también afectaron significativamente a los genes asociados con la cadena respiratoria PAO1. Las cbb3 oxidasas permiten que P. aeruginosa crezca en entornos con poco oxígeno (como biopelículas) y se expresan más en P. aeruginosa en condiciones anóxicas23. Por lo tanto, la expresión reducida de las cbb3 oxidasas ccoN2 y ccoP2 en presencia de AMP podría ser una indicación de una agregación reducida y una posible actividad peptídica anti-biopelícula. Se ha demostrado que la NO-reductasa protege a las bacterias patógenas contra el NO, un radical libre tóxico producido por los macrófagos del huésped24. El aumento de la expresión de las subunidades norB y norC de la NO-reductasa por PAO1 en presencia de Lynronne 1, 2 y P15 indica una posible inhibición respiratoria y una respuesta al estrés ante la acumulación de NO.

Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y análisis de conglomerados jerárquicos (HCA): mapa de calor basado en los 20 genes de variables principales, destacando las diferencias entre los grupos de muestras no tratados y con péptidos Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 para la cepa de P. aeruginosa ( a) PAO1 y (b) LES431.

Los perfiles de metabolitos de PAO1 y LES431 se obtuvieron después de 1 h de tratamiento a una concentración de CIM con Lynronne 1, Lynronne 2, P15 y grupos de control no tratados. A partir del análisis de componentes principales supervisado (PLS-DA), fue posible ver grupos distintos para los diferentes tratamientos antimicrobianos tanto para PAO1 como para LES431 (Fig. 6a, b). Lo que sugiere que los péptidos pueden apuntar a vías metabólicas únicas. El análisis de agrupamiento jerárquico después de un ANOVA unidireccional muestra los metabolitos expresados ​​de manera más significativa en los grupos de tratamiento y control (Fig. 6a, b). Para LES431, los grupos de péptidos parecen estar más agrupados y se puede observar una distinción más clara entre los grupos de péptidos y de control. Para LES431 se muestra el análisis univariante de metabolitos individuales con las diferencias más significativas entre los grupos de tratamiento y control (Fig. 7). Los gráficos resaltan diferencias significativas en la expresión de metabolitos, principalmente para fosfatidiletanolamina y glicerol, entre los grupos de tratamiento con péptidos. Para PAO1, fue más difícil distinguir diferencias significativas de metabolitos entre los grupos de tratamiento. Sin embargo, la ornitina se destaca como uno de los metabolitos expresados ​​de manera más significativa en PAO1, un componente crucial del metabolismo de la arginina y se transporta fuera de la célula a través de la vía ADI22. Esto resalta un vínculo potencial entre los conjuntos de datos 'ómicos, ya que se demostró que los genes de los operones de arco involucrados en la vía ADI se ven afectados por los AMP en el análisis de secuencia de ARN. Tras una evaluación de los datos metabolómicos de PAO1 y LES431 combinados, es evidente que ambas cepas son metabolómicamente distintas y, por lo tanto, deben considerarse de forma independiente (Figura 4 complementaria).

PLS-DA y análisis de conglomerados jerárquicos (HCA): mapa de calor para espectrometría de masas por electropulverización con inyección de flujo de ionización negativa (FIE-MS) generado en base a los 25 metabolitos más importantes mediante ANOVA unidireccional, para los grupos de metabolitos peptídicos (Lynronne 1, Lynronne 2 y P15) y el grupo de metabolitos no tratados (a) PAO1 y (b) LES431. Metabolitos identificados en modo de ionización negativa FIE-MS.

Diagramas de caja de metabolitos individuales (a – c) fosfatidiletanolaminas, (d) diglicérido y (e) glicerol, que muestran diferencias de concentración relativa entre los grupos de péptidos y no tratados. Línea a través del cuadro: mediana, cuadrado: media, cuadro: percentiles 25 y 75, bigotes: percentiles 5 y 95 (prueba t univariada, P <0,05).

Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 no mostraron efectos tóxicos en ninguna de las concentraciones probadas después de 96 h de inoculación en G. mellonella (Figura complementaria 5). La dosis infecciosa de PAO1 (LD50) se determinó como ~1,15 × 102 UFC/larva, mientras que la dosis letal (LD) se determinó como ~1,17 × 104 UFC/larva (causó melanización y muerte de todas las larvas antes de 24 h). Luego se evaluó el efecto de los péptidos en la protección de las larvas de una infección por PAO1 utilizando ~1,17 × 104 o ~1,32 × 103 UFC/larva PAO1. Para el grupo de larvas infectadas con 104 células; la tasa de mortalidad fue del 100 % a las 24 h (Fig. 8a). Las larvas infectadas con 103 células tuvieron un 50% de supervivencia a las 24 h, pero un 100% de muerte a las 48 h (Fig. 8b). Las larvas infectadas tratadas con Lynronne 1 (32 mg/kg) o Lynronne 2 (128 mg/kg) mostraron una supervivencia del 100 % con una densidad de infección de 103 y 104 UFC/larva después de 24 h. El tratamiento con P15 a 128 mg/kg no evitó la muerte de las larvas tras la infección con 104 UFC/larva, sin embargo, el tratamiento con P15 a 384 mg/kg presentó una tasa de supervivencia del 60% después de 24 h y del 10% después de 48 h ( Figura 8a). Después de la infección con 103 UFC/larvas, la tasa de supervivencia con el tratamiento con P15 a 384 mg/kg aumentó significativamente, en comparación con las larvas infectadas no tratadas (comparación por pares, P = 0,00467). Para el análisis estadístico, se realizó una comparación simple por pares para comparar el efecto de un AMP entre las dosis de antimicrobianos y el grupo de control. La mezcla de bacterias y AMP especificado antes de la inyección se mantuvo en menos de un minuto, por lo tanto, no afectaría la importancia ya que los datos de la cinética de muerte en el tiempo para todos los AMP mostraron una muerte completa >50 minutos para PAO1. No se observó melanización ni muerte en las larvas inoculadas con PBS. Además, las larvas tratadas con Lynronne 1 y Lynronne 2 no mostraron melanización después de 96 h (Fig. 8c). La muerte de las larvas tratadas con P15 fue seguida de melanización durante los días de evaluación (Fig. 8c).

a Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de G. mellonella infectadas con 104 UFC/larvas. b Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de G. mellonella infectadas con 103 UFC/larvas de P. aeruginosa PAO1. c Imágenes representativas que muestran la melanización de larvas tratadas con los péptidos durante 96 h.

Se ha demostrado que los péptidos antimicrobianos derivados del microbioma ruminal son activos contra un amplio espectro de organismos2. La evaluación de la actividad antimicrobiana in vitro e in vivo en este estudio encontró que estos candidatos a AMP eran eficaces contra cepas clínicamente aisladas de P. aeruginosa que mostraban un mayor potencial como moléculas terapéuticas.

Los valores de CIM y CMB obtenidos en este estudio están en línea e incluso mejores que los encontrados con otros AMP contra P. aeruginosa25 pero modestos en comparación con antibióticos convencionales como levofloxacino y polimixina B, debido a los diferentes modos de acción. La menor susceptibilidad a los péptidos, exhibida por cepas como la cepa epidémica australiana (AES-1R), podría atribuirse a una mayor proporción de genes asociados a la membrana externa y una menor proporción de genes citoplasmáticos26. En comparación con otras cepas como C3719, una mayor actividad de porinas de AES-1R podría ser responsable del aumento del valor de MIC.

A lo largo de este estudio, es evidente que el péptido P15 de hoja β actúa de manera distinta de los péptidos Lynronne 1 y Lynronne 2 de hélice α, y la raíz de estas diferencias de eficacia probablemente sea atribuible a su adopción estructural. A pesar de potenciales de actividad antimicrobiana similares, se sabe que los AMP catiónicos que adoptan estructuras anfipáticas de hélice α o de lámina β pueden diferir mucho en su capacidad para unirse y alterar las membranas celulares, y las conformaciones de lámina β a menudo resultan menos líticas27. Como indicaron anteriormente Oyama et al., Lynronne 1 y Lynronne 2 tienen una carga positiva neta (+6 y +5) con una relación de hidrofobicidad (≥40%), mayor que la observada para los P15 (35%)2. Diferencias menores en la hidrofobicidad de los péptidos y la distribución de carga pueden tener un impacto considerable en la penetración y alteración de las capacidades de las membranas bacterianas y determinar el nivel de daño a las membranas de los mamíferos hospedadores28.

Lynronne 1 y Lynronne 2 exhibieron una rápida destrucción bactericida contra los aislados de P. aeruginosa PAO1 y LES431 con una reducción de ≥3 log UFC/mL dentro de los primeros 60 minutos y 10 minutos de tratamiento, respectivamente. Los P15 mostraron una actividad bactericida similar en cultivos de LES431, pero no en cultivos de PAO1. Estos datos sugieren que los P15 pueden utilizar un mecanismo de acción alternativo a Lynronne 1 y Lynronne 2. También especulamos que la diferencia en la actividad de los AMP entre PAO1 y LES431 puede deberse a sus distintos perfiles de expresión de lipopolisacáridos (LPS). Se podría esperar una eficacia reducida de AMP contra PAO1, ya que LES431 ha demostrado exhibir capacidades más débiles de motilidad, enjambre y formación de biopelículas29. A su vez, esto puede dar como resultado efectos bactericidas más bajos contra cepas de mayor densidad de crecimiento, como PAO1. Los compuestos de referencia, levofloxacina y polimixina B, mostraron una destrucción bactericida reducida contra LES431 en comparación con PAO1. Contra cepas menos susceptibles como PAO1, Lynronne 1, 2 y P15 puede que no sea necesario administrarlos de forma monoterapéutica y podrían utilizarse en combinación con otros compuestos convencionales para generar efectos sinérgicos25.

Una vez establecida, P. aeruginosa es notoriamente difícil de tratar. Entre otros factores, P. aeruginosa puede crecer rápidamente dentro de una biopelícula y reducir la eficacia de las defensas del huésped o del tratamiento antimicrobiano30. Estas biopelículas son un problema importante en la clínica y a menudo se presentan en huéspedes susceptibles con quemaduras o heridas crónicas, trastorno pulmonar obstructivo crónico (EPOC), fibrosis quística, biomateriales implantados y suministros de agua31. Los AMP pudieron prevenir la formación de biopelículas en ambas cepas PAO1 y LES431, sin embargo, no fueron capaces de desalojar significativamente las biopelículas preestablecidas. Por lo tanto, sería más óptima una acción rápida contra el número máximo de células bacterianas antes de que entren y progresen hacia el fenotipo de biopelícula32. Los AMP con propiedades de inhibición de la formación de biopelículas no deben pasarse por alto y podrían tener aplicaciones únicas, por ejemplo, en la prevención de infecciones asociadas a catéteres urinarios mediante el uso de un recubrimiento peptídico antimicrobiano33,34. Alternativamente, la combinación de estos péptidos antimicrobianos con antibióticos convencionales que se sabe que se dirigen a distintas subpoblaciones fisiológicas de P. aeruginosa también podría mejorar la erradicación de biopelículas35. Además, puede ser que una combinación de Lynronne 1, Lynronne 2 o P15 junto con el tratamiento físico de las biopelículas, como la inactivación fotodinámica, pueda inducir el desprendimiento de la biopelícula, aumentando así la eficacia antimicrobiana contra las biopelículas preestablecidas16,36.

Es importante destacar que los ensayos de mutagénesis de pases en serie no presentaron mutantes resistentes contra los AMP derivados del microbioma ruminal probados en este estudio. La naturaleza de acción rápida de los compuestos probablemente redujo el potencial de adquisición de resistencia de PAO1 y LES431, incluso en concentraciones subletales. La ausencia de mutantes resistentes sugiere que Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 pueden tener múltiples objetivos celulares y resalta su promesa como posibles agentes terapéuticos. La resistencia a los AMP catiónicos se ha señalado en la literatura como un obstáculo emergente que compromete la eficacia de los AMP19. Sin embargo, la resistencia a compuestos similares a AMP es a menudo el resultado de una presión selectiva, más que de la adquisición de genes resistentes específicos mediante la transferencia horizontal de genes20. Por lo tanto, es de esperar un aumento gradual de la resistencia o "deslizamiento de las CIM" tras la exposición repetida a fármacos basados ​​en AMP. Además, los estudios farmacodinámicos han demostrado que in vivo la probabilidad de evolución de resistencia es menor en los AMP en comparación con los antibióticos convencionales37.

P. aeruginosa puede causar infecciones pulmonares graves en pacientes con fibrosis quística, debido al origen de la muestra clínica y la premisa de estos AMP, por lo que era apropiado probar la citotoxicidad de los péptidos en células pulmonares humanas. A pesar de una mayor actividad contra PAO1 y LES431 en las pruebas de susceptibilidad, Lynronne 1 parece ser citotóxica en concentraciones más bajas (~200 µg/mL) para las líneas celulares de pulmón humano IMR90 y BEAS-2B. Los mecanismos de acción alternativos y las diferencias en la hidrofobicidad pueden explicar la mayor toxicidad de Lynronne 1 y 2 para las células humanas. Se ha demostrado que la hidrofobicidad de los péptidos y la distribución de carga juegan un papel clave en la penetración y alteración de las membranas lipídicas y, por lo tanto, determinan la toxicidad de los péptidos antimicrobianos catiónicos para las células de mamíferos28. Para mejorar la eficacia, la estabilidad de Lynronne 1 podría mejorarse con mejoras de síntesis. Se ha demostrado que la modificación parcial de un AMP, como la sustitución de D-aminoácidos, reduce la citotoxicidad38. Se reveló que P15 era el menos citotóxico tanto para IMR90 como para BEAS-2B, lo que indica que el compuesto podría emplearse en concentraciones más altas. Una vez más, los P15 exhiben características únicas en comparación con Lynronne 1 y Lynronne 2, lo que proporciona evidencia que respalda un mecanismo de acción distinto y un modelo para investigar más a fondo cualquier diferencia mecanística.

Debido a su selectividad celular innata, mantener un índice terapéutico (TI) suficientemente grande para los AMP en comparación con las células huésped no objetivo es un desafío39. Aunque la composición de la membrana celular de las células diana y no diana es distinta, los AMP tanto naturales como sintéticos a menudo ejercen una toxicidad colateral no deseada en las células de mamíferos40,41. Lynronne 1 exhibió el TI más bajo de los AMP probados, lo que sugiere que la citotoxicidad del péptido para las células BEAS-2B e IMR90 podría superar los beneficios de una mayor actividad antimicrobiana contra PAO1 y LES431. El TI más alto para Lynronne 2 y P15 en comparación con Lynronne 1 indica que, sin modificaciones, Lynronne 2 y P15 serían los candidatos más seguros para el desarrollo en aplicaciones terapéuticas con respecto a la toxicidad.

El uso de TEM para observar alteraciones en la integridad de la membrana bacteriana puede desempeñar un papel importante a la hora de aclarar los mecanismos de muerte celular en concentraciones letales de AMP42. En este estudio, TEM proporcionó confirmación visual de las diferencias propuestas en el mecanismo de acción entre Lynronne 1 y P15. La morfología celular de las células PAO1 tratadas con Lynronne 1 mostró una alteración considerable de la integridad celular en comparación con las P15, lo que confirma el mecanismo de acción de la alteración celular.

Se utilizaron transcriptómica y metabolómica para evaluar más a fondo el mecanismo de acción de Lynronne 1, 2 y P15 contra las cepas PAO1 y LES43 después de 1 h de exposición. Cabe señalar que la inferencia del mecanismo de acción a partir del análisis ómico es compleja y P. aeruginosa puede presentar varios cambios de expresión independientes en presencia de antimicrobianos no asociados con el mecanismo de acción. La anotación del transcriptoma PAO1 reveló que los genes más variables probablemente estén asociados con la respuesta al estrés, incluida la actividad catalítica y las actividades transmembrana. Al igual que otros tratamientos con péptidos antimicrobianos catiónicos conocidos, la alteración de la membrana celular bacteriana es un mecanismo de acción común2,42. Un análisis más detallado de expresiones genéticas significativas mediante el análisis de enriquecimiento GO descubrió información sobre el efecto del péptido sobre la función molecular. Las bacterias patógenas han desarrollado diferentes estrategias para atacar la arginina y la vía ADI para la autoconservación22. El metabolismo de la arginina a través de la vía ADI permite que los microorganismos se adapten a las defensas del huésped y a los nichos ambientales hostiles43. La vía ADI requiere múltiples enzimas codificadas por genes del operón arc, incluidos arcA, arcB y arcC, que hidrolizan la arginina a ornitina produciendo subproductos de ATP, CO2 y amoníaco22,43,44. La producción de amoníaco y ATP protege a las bacterias al permitir el mantenimiento de la homeostasis del pH citoplasmático44. Se ha demostrado que las funciones metabólicas de la arginina y la vía ADI son cruciales para la supervivencia bacteriana en condiciones ambientales cambiantes44 y una interrupción significativa de esta vía por parte de Lynronne 1 y Lynronne 2 probablemente inhibiría la respuesta adaptativa al estrés de PAO1. La vía ADI depende del transporte de arginina dentro y ornitina fuera de la célula, y esto está regulado por el antiportador arginina-ornitina (arcD) en la membrana celular bacteriana22. A partir de los datos de enriquecimiento, parece que la presencia de P15 puede ser distinta de Lynronne 1 y 2, ya que no reduce la expresión de arcA, arcB y arcC de manera tan significativa. Sin embargo, parece tener un impacto más indirecto en el metabolismo de la arginina al reducir significativamente la expresión de arcD. P. aeruginosa tiene cinco oxidasas terminales que incluyen dos citocromo c oxidasas de tipo cbb3 esenciales para la respiración aeróbica y utiliza estas oxidasas en diferentes condiciones de crecimiento a través de combinaciones de isoformas de subunidades CcoN, CcoO y CcoP45. La evaluación transcriptómica reveló una expresión significativamente mayor de genes como ccoN2 y ccoP2 asociados con la cadena respiratoria en PAO1 no tratado en comparación con todos los tratamientos con péptidos, más notablemente con P15. La expresión reducida de ccoN2 y ccoP2 podría reflejar la alteración de la membrana del péptido antimicrobiano de PAO1 y el mantenimiento del potencial electroquímico y la producción de ATP por parte del organismo, ya que estos genes se localizan dentro de la membrana citoplasmática y la vesícula de la membrana externa. La regulación negativa de genes asociados con la cadena respiratoria también podría ser un signo de una capacidad reducida de adaptación en condiciones de bajo oxígeno, como las biopelículas45. Los genes alternativos asociados a la cadena respiratoria, norB y norC, codifican subunidades del citocromo de la NO-reductasa, y esta enzima activa cataliza la reducción de NO a N2046. La NO-reductasa funciona como una enzima respiratoria que conserva la energía anaeróbica y la desintoxicación del NO46 exógeno. Se ha demostrado que P. aeruginosa deficiente en NO-reductasa tiene una supervivencia reducida contra el ataque nitrosativo del sistema inmunológico del huésped24,46. El aumento de la expresión de NO-reductasa de manera más significativa en P15 pero también en Lynronne 1 y Lynronne 2, sugiere que en presencia de AMP puede haber una mayor acumulación del intermediario tóxico de NO dentro de PAO1. Además, la regulación negativa de los genes norB y norC podría indicar aún más una interacción con la membrana, ya que estos genes están localizados dentro de la membrana citoplasmática. Como era de esperar, muchos de los genes de las principales variables destacados para LES431 aún no se han caracterizado y no se dispone de información sobre su función. A partir del análisis transcriptómico de PAO1 y ensayos bactericidas previos, después de 1 h de tratamiento con los péptidos, planteamos la hipótesis de que es probable que ya se haya producido una muerte significativa. Por lo tanto, se espera que los genes asociados con la respuesta al estrés y las vías asociadas a la membrana se vean afectados tanto en PAO1 como en LES431.

G. mellonella se utilizó para la evaluación in vivo de la eficacia, ya que se destaca como un sistema modelo apropiado para identificar los factores de virulencia de P. aeruginosa en mamíferos47 y puede revelar conocimientos sobre la farmacocinética antimicrobiana y los efectos terapéuticos48. A partir de los datos de este estudio, es evidente que Lynronne 1 y Lynronne 2 fueron eficaces contra PAO1 in vivo, con una tasa de supervivencia de las larvas del 100 %. Por el contrario, a pesar de haber demostrado ser mucho menos citotóxico en ensayos anteriores, el tratamiento de las larvas con P15 a 128 mg/kg provocó melanización visual y muerte en 24 h. Esto puede deberse a la muerte relativamente más lenta de P15, como se observa en los ensayos de muerte temporal, lo que permite que PAO1 forme agregaciones bacterianas desinhibidas cuyo crecimiento es más difícil de evitar. A pesar de esto, es importante señalar que la supervivencia de G. mellonella mejoró cuando se trató con P15 en concentraciones más altas (384 mg/kg).

Debido a su eficacia demostrada en la evaluación primaria in vivo, es posible que Lynronne 1 sufra modificaciones parciales para reducir su citotoxicidad. Lynronne 2 y P15 también podrían modificarse parcialmente y aplicarse en concentraciones considerablemente más altas que Lynronne 1 sin efectos citotóxicos. En resumen, este estudio proporciona los datos preclínicos fundamentales necesarios para determinar la viabilidad de estos AMP como futuras terapias alternativas, particularmente para el tratamiento de infecciones por P. aeruginosa.

El modelado de conformación 3D del péptido 15 S se llevó a cabo utilizando el método de predicción estructural de novo PEP-FOLD49. Se utilizó el programa de software PyMOL v1.7.6 para visualizar los resultados (Schrödinger, LLC (The PyMOL Molecular Graphics System, Versión 1.7.6, 2010).

Las CIM se determinaron utilizando un método de microdilución en caldo modificado50 en caldo Mueller Hinton (MHB) ajustado con cationes (ajustado con cationes), caldo de soja tríptico (TSB), caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) siguiendo el estándar 20776-1 de la Organización Internacional de Normalización. para pruebas de CIM con una concentración final de inóculo bacteriano de 5 × 105 UFC/mL51. Los péptidos y los antibióticos comparadores se disolvieron en agua destilada estéril y se agregaron a microplacas de 96 pocillos de polipropileno con fondo en U estériles en las concentraciones deseadas. La CMI se definió como la concentración más baja de péptido o antibiótico necesaria para inhibir el crecimiento visible de bacterias después de 18 a 24 h de incubación a 37 °C. Inmediatamente después se determinó una Concentración Bactericida Mínima (CBM). Se tomaron submuestras de cada pocillo de placa de MIC individual y se sembraron 5 μl en agar MH (o medios alternativos dependiendo de los medios utilizados para la MIC real), luego se incubaron durante la noche a 37 °C. Cualquier crecimiento de colonia visible se registró al día siguiente para determinar el valor de MBC, es decir, cuando no se observó crecimiento.

Se realizó una evaluación de los tiempos de destrucción de los péptidos y del antibiótico de comparación (levofloxacina) frente a las cepas de P. aeruginosa PAO1 y LES43152. Los cultivos en fase exponencial de PAO1 y LES431 se cultivaron en MHB (1 × 108–10 UFC / ml) y se trataron con péptidos (Lynronne 1, 2, 3 y P15) en concentraciones tres veces mayores que sus valores de MIC. Las muestras se diluyeron en serie en solución salina tamponada con fosfato y se sembraron en placas sobre MHA. Después de la incubación a 37 °C durante 18 a 24 h, se registró el número de colonias2,52. Los experimentos se realizaron por triplicado y se calcularon las UFC/mL en diferentes momentos después de la incubación durante la noche.

Para evaluar la eficacia de los péptidos Lynronne 1, 2, 3 y P15 en la prevención y alteración de biopelículas preestablecidas, se adoptó un método de placa de 96 pocillos2. Para prevenir la unión de biopelículas, se cultivaron y resuspendieron en MHB cultivos nocturnos de P. aeruginosa PAO1 y LES431. Individualmente, se agregaron péptidos a 3X MIC a los cultivos resuspendidos, luego se agregaron a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se colocaron en una incubadora estática a 37 °C durante 24 h más. Después de la incubación, las células planctónicas se lavaron de las biopelículas utilizando un mínimo de tres pasos de lavado con PBS. Las biopelículas se fijaron con metanol durante 20 minutos, se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,4% (p/v) durante 20 minutos y se resolubilizaron con ácido acético al 33% (v/v). Se usó un espectrofotómetro de microplacas para medir las biopelículas resolubilizadas a 570 nm; debido a las diferencias en la DO inicial para las réplicas de biopelículas, la actividad de la biopelícula se representó como porcentaje de reducción en la DO5700 nm. La significación estadística se calculó utilizando un ANOVA de un solo factor.

Para medir la alteración de biopelículas preestablecidas, el ensayo se modificó para agregar una incubación adicional. Se diluyeron cultivos nocturnos de P. aeruginosa PAO1 y LES431 y se agregaron a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos sin tratamiento y se colocaron en una incubadora estática a 37 °C durante 24 h. Las células planctónicas se eliminaron mediante tres lavados con PBS y luego se agregaron MH fresco con compuestos antimicrobianos a 3X MIC. A esto le siguieron 24 h más de incubación estática a 37 °C. Las células planctónicas se eliminaron una vez más con lavados con PBS y los pasos de fijación, tinción, resolubilización y lectura de densidad óptica de la biopelícula siguieron siendo los mismos.

Los cultivos de las cepas PAO1 y LES431 de P. aeruginosa se sometieron continuamente a Lynronne 1, 2, 3 y P15 durante un período de 25 días para exponer la posible resistencia a AMP. Como se describe en el protocolo MIC anterior, para el primer paso, la prueba de susceptibilidad a la microdilución en caldo se realizó utilizando la serie de dilución doble estándar usando Muller Hinton ajustado para cationes. La MIC se determinó después de la incubación de los cultivos durante 24 h. Luego, los pocillos que contenían la concentración más alta de AMP que permitían el crecimiento se diluyeron 1:1000 en MHB y se utilizaron como inóculo para el ensayo de MIC posterior. Este proceso se repitió durante 25 días.

Se determinó la actividad citotóxica de los péptidos derivados del rumen contra células BEAS-2B (ATCC CRL-9609) e IMR90 (ATCC CCL-186). Las líneas celulares BEAS-2B e IMR90 se cultivaron en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS), 1% de l-glutamina y 1% de antibióticos (todos Invitrogen). Las células se cultivaron de forma rutinaria en matraces de 25 cm2 mantenidos en una incubadora con CO2 al 5% a 37 °C. Las células cultivadas en matraces de 25 cm2 se separaron usando una solución de tripsina-EDTA (Thermofisher) y se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos (Greiner Bio-one) a ~104 células por pocillo (contadas usando la cámara de Malassez) y se incubaron a 37 ° C, incubadora con 5% de CO2 hasta que alcanzaron la confluencia (~48–72 h después de la siembra). Luego se aspiraron los pocillos y se agregaron concentraciones crecientes de péptidos a las células, seguido de una incubación durante 48 h a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Posteriormente, se aspiraron los pocillos y se determinó la viabilidad celular utilizando un kit de ensayo de toxicidad in vitro basado en resazurina (Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución madre de resazurina se diluyó a 1:100 en PBS estéril que contenía calcio y magnesio (PBS++, pH 7,4) y los pocillos vaciados se llenaron con 100 µl de la solución diluida de resazurina. Después de 4 h de incubación a 37 °C, se midió la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas (longitud de onda de excitación de 530 nm/longitud de onda de emisión de 590 nm). Los valores de fluorescencia fueron normalizados por los controles y expresados ​​como porcentaje de viabilidad celular. Los valores de IC50 (es decir, la concentración de péptidos que causan una reducción del 50% de la viabilidad celular) se calcularon utilizando el software GraphPad® Prism 7. Se utilizó un parámetro de regresión no lineal para la curva, preestablecido como respuesta a la dosis para determinar la inhibición frente a la respuesta normalizada.

El índice terapéutico (TI) de AMP se calculó dividiendo los valores de IC50 para cada línea celular (BEAS-2B o IMR90) con el valor de MIC dado para cada organismo (PAO1 o LES431). Los valores de error estándar (+/-) siguen al TI y los valores de MIC se colocaron entre paréntesis como referencia.

Los efectos de Lynronne 1 y P15 sobre la morfología de las células bacterianas PAO1 se investigaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los cultivos bacterianos en la fase logarítmica media se trataron con Lynronne 1 y P15 de forma independiente (a 3 × MIC durante 1 h) y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5% (v/v). Las células se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 1% (p/v), se tiñeron con acetato de uranilo al 2% (p/v) y citrato de plomo de Reynold y se evaluaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM1010 (JEOL Ltd, Tokio, Japón) a 80ºC. kilovoltios. TEM fue realizado por Alan Cookson, del Laboratorio de Microscopía Avanzada y Bioimágenes de la Universidad IBERS Aberystwyth.

Se utilizaron ensayos de yoduro de propidio para evaluar la permeabilización de la membrana utilizando CTAB (300 µM) como control. La interacción péptido-lípido se midió utilizando una monocapa lipídica reconstituida (equilibrio de Langmuir). Se utilizó la extracción de Folch para obtener extractos lipídicos completos de cultivos nocturnos de cepas de P. aeruginosa, luego se resuspendieron en cloroformo y se almacenaron en condiciones de nitrógeno a -20 °C. También se resuspendieron en cloroformo (1 mg/ml) y se almacenaron en las mismas condiciones lípidos bacterianos y eucarióticos puros, PE, PG, PC, cardiolipina, LTA y LPS (Avanti Polar Lipid, EE. UU.). Fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina, Fosfatidilglicerol (PC) y fosfatidiletanolamina (PE). El fosfatidilglicerol (PG) y la cardiolipina representan lípidos abundantes en la superficie de la membrana bacteriana. El fosfatidilglicerol (PC) representa el principal lípido presente en la superficie de las membranas eucariotas, mientras que la fosfatidiletanolamina (PE) está presente en las membranas interna y externa de las membranas bacterianas y eucariotas. La interacción de los péptidos con extractos lipídicos totales de Pseudomonas o lípidos puros se evaluó mediante la medición de su presión crítica de inserción53. La presión crítica de inserción se determinó cambiando la presión inicial de la monocapa lipídica (de 10 y 30 mN/m) y midiendo la variación de presión causada por la inyección del péptido (a una concentración final de 1 µg/ml). Brevemente, se agregaron lípidos hasta que se alcanzó la presión superficial inicial deseada. Después de un período de incubación de 5 a 10 minutos necesario para permitir la evaporación del disolvente y la estabilización de la presión superficial inicial, se inyectaron péptidos en la subfase en el PBS (pH 7,4, volumen 800 µl) utilizando una jeringa Hamilton de 10 µl. Las variaciones de la presión superficial causadas por la inserción del péptido en la monocapa lipídica se midieron continuamente utilizando un microtensiómetro completamente automatizado (μTROUGH SX, Kibron Inc., Helsinki, Finlandia) hasta que se alcanzó el equilibrio (~20 min para obtener la presión superficial máxima en la mayoría de los casos). Todos los experimentos se llevaron a cabo en una atmósfera controlada a 20 °C ± 1 °C y los datos se analizaron utilizando el programa Filmware 2.5 (Kibron Inc., Helsinki, Finlandia). La variación de la presión superficial se representó en función de la presión superficial inicial y la presión crítica de inserción se calculó como el valor teórico de la presión inicial de la monocapa lipídica no permisiva para la inserción del péptido, es decir, una variación de presión igual a 0 mN/m. Se determinó que la precisión del sistema en nuestras condiciones experimentales era ±0,25 mN/m para mediciones de presión superficial.

Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 contra LES431 y PAO1 se investigaron mediante análisis transcriptómico siguiendo métodos preestablecidos54. Se inocularon cultivos bacterianos durante la noche en MHB utilizando un método de suspensión directa de colonias y se incubaron a 37 ° C (200 rpm) para alcanzar una fase de crecimiento logarítmico medio (aproximadamente OD600 0,35–0,5). Después de esto, se tomó una alícuota de 2 × 106 UFC/ml del cultivo y se diluyó en MHB. Luego, las cepas cultivadas se trataron con Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 en sus respectivas concentraciones de CIM (n = 3). El tiempo de tratamiento se limitó a 1 h para mantener la calidad y el rendimiento del ARN; todos los cultivos no tratados se utilizaron como control.

Después del tratamiento, todas las suspensiones se lavaron dos veces y se resuspendieron en una mezcla de PBS y reactivo RNAprotect Bacteria (QIAGEN, Hilden, Alemania) (1:2). Esta suspensión se agitó rápidamente y se incubó a temperatura ambiente (20 °C ± 1 °C) durante 5 minutos, antes de la centrifugación a 5000 xg durante 10 minutos. Al sedimento formado se le añadió proteinasa K (QIAGEN) y una mezcla de lisis bacteriana (QIAGEN) que consistía en mutanolisina y lisozima. Luego se podría agregar tampón Tris-EDTA, agitar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos más. Luego se utilizó un mini kit RNeasy Plus (QIAGEN) para realizar el proceso de extracción de ARN en las células tratadas, siguiendo las pautas del fabricante. Se utilizó un fluorómetro Qubit™ con un kit de ARN de amplio rango (Invitrogen, EE. UU.) para cuantificar las muestras de ARN total según las instrucciones del fabricante.

El ARN total se sometió a agotamiento del ARN ribosomal utilizando el kit MICROBExpressTM (Thermo Fisher) según las pautas del fabricante. Luego se utilizaron cuatrocientos ng de ARNm enriquecido para preparar bibliotecas de secuenciación de doble índice con el kit de preparación de muestras de ARNm trenzado Illumina® TruSeq® siguiendo el protocolo de Illumina (se omitió el paso de enriquecimiento con poli-A). Luego, las bibliotecas se cuantificaron utilizando el espectrofotómetro de placas EpochTM (BIOTEK) antes de la combinación, y el conjunto de bibliotecas final se cuantificó mediante QubitTM. El tamaño de los amplicones se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa, luego el conjunto de bibliotecas se diluyó a 10 nM según la concentración de ADN y el tamaño promedio de los amplicones. Luego, este conjunto de stock se diluyó a 8 pM para la secuenciación en formato de 2 × 125 pb en una plataforma Illumina HiSeq 2500.

La incubación bacteriana se mantuvo consistente con todos los ensayos anteriores (200 rpm a 37 °C durante la noche). Para cada aislado, se trataron individualmente seis réplicas biológicas con el péptido relevante, excepto el grupo de control que permaneció sin tratar. Después de la incubación posterior, todas las muestras se recolectaron durante la fase de crecimiento exponencial medio. Se tomó una alícuota de cultivo bacteriano en momentos de tiempo predeterminados; 1 h después del tratamiento con un compuesto de prueba. Se utilizó N2 líquido para congelar rápidamente las muestras, deteniendo cualquier metabolismo celular adicional. Luego, estas muestras se almacenaron a -80 ° C hasta que se completó todo el muestreo.

La extracción de metabolitos de las muestras se realizó mediante un método desarrollado por Baptista et al.55. Tras la descongelación, todas las muestras se centrifugaron a 10 °C, 1800 × g. Luego, individualmente, las muestras se lavaron con una solución salina (NaCl al 0,85%) y se centrifugaron nuevamente en las mismas condiciones. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió una vez más en una solución salina. Todas las muestras se ajustaron a una DO600 de 1 antes de agregar 200 µl de tampón de extracción, solución de cloroformo/metanol/agua (1:3:1). Se utilizaron cuatro ciclos rápidos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido y agitación periódica para lograr una extracción suficiente. Luego, todas las muestras se centrifugaron por última vez (10 ° C, 1800 × g) y se transfirieron a nuevos tubos de microcentrífuga. Se transfirieron cincuenta microlitros de esta mezcla final a un vial de HPLC que contenía un microinserto de fondo plano de 0,2 ml necesario para el análisis de espectrometría de masas de alta resolución (FIE-HRMS) de iones de electropulverización de infusión de flujo.

La toma de huellas dactilares de metabolitos mediante espectrometría de masas de alta resolución por electropulverización de inyección de flujo (FIE-HRMS) se realizó utilizando un analizador de masas Exactive HCD. El sistema está equipado con un sistema Accela UHPLC (Thermo-Scientific) que puede generar huellas dactilares de metabolitos en modos de ionización positiva y negativa, en una sola ejecución. Las muestras se inyectaron en un flujo de 100 µl min-1 de metanol y agua (70:30). Las intensidades de los iones se registraron con una m/z entre 50 y 1000 durante 3,5 minutos a una resolución de 100.000 (m/z 200), con un nivel de precisión de masa de ppm de 3 (±1).

Las secuencias de ARN como archivos 'fastq' exportados desde Miseq/Hiseq se emparejaron, recortaron y comprobaron su calidad en consecuencia utilizando Trimmomatic (v0.38)56 y FastQC/MultiQC (v0.11.9/v1.11). Para ambas cepas, se cortaron todas las secuencias específicas de Illumina y las regiones adaptadoras (119 bases en total). Se utilizó Kallisto (v. kallisto 0.44.0)57 como herramienta de mapeo de los genomas de referencia, y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando DESEQ258 sin umbral (5573 PAO1 y 5965 LES431 genes expresados ​​diferencialmente). Los datos numéricos se exportaron desde el programa de conteo de lecturas y se ingresaron en R para el análisis estadístico. Se utilizó el recurso en línea Geneontology.org para determinar las designaciones de genes para los genes importantes identificados en DESEQ2, Padj de <= 0,05 y se utilizó un cambio logarítmico de >=2 para realizar los gráficos del volcán, se utilizó ShinyGO 0,76 para el análisis de enriquecimiento GO cifras.

Para la metabolómica, se utilizaron las recomendaciones del fabricante para establecer los parámetros de origen ESI, y todos los archivos sin procesar se convirtieron a archivos CDF, para alinearlos en masa y centroides en MATLAB (V8.2.0, The Math Works) manteniendo la mayor precisión de masa. Para cada modo iónico, los espectros de masas alrededor del vértice del pico de infusión se combinaron en una matriz de intensidad única (ejecuciones × m/z). Antes de un análisis estadístico adicional, todos los datos de la matriz de intensidad se transformaron logarítmicamente. La principal plataforma de análisis estadístico utilizada para generar cifras de PCA y Heatmap para el conjunto de datos de metabolómica fue MetaboAnalyst 4.059; este software también admitió el análisis integrador entre los conjuntos de datos de transcriptómica y metabolómica.

Las larvas de G. mellonella se cultivaron y mantuvieron en el laboratorio en las condiciones de dieta, manipulación y cultivo descritas60. Las larvas utilizadas constituyen un cultivo clonal de varias generaciones conservado en el laboratorio. Se seleccionaron aleatoriamente diez (10) larvas con un peso medio de 275 mg cada una para pruebas de citotoxicidad y eficacia por duplicado (réplicas biológicas). En los experimentos no se utilizaron larvas con melanización previa de la cutícula. Para las pruebas de citotoxicidad, se inyectaron los péptidos Lynronne 1, Lynronne 2 y P15 en la última pata prolongada de las larvas a la concentración de CIM, es decir, 32 mg/kg de peso corporal de larvas (LBW) para Lynronne 1 y 128 mg/kg LBW para Lynronne 2 y P15. ; y 3x CIM, concretamente 96 mg/kg de BPN para Lynronne 1 y 384 mg/kg de BPN para Lynronne 2 y P15, según se determina en el ensayo de CIM. Las larvas se mantuvieron a 37 °C en la oscuridad. Los aspectos fenotípicos de supervivencia como actividad, melanización, producción de capullos (grado de producción de seda) y supervivencia se controlaron cada 24 h durante 96 h. El grupo control correspondió a larvas que recibieron inyección con agua (ensayos de toxicidad de péptidos) o PBS (determinación de dosis letal50—LD50 y dosis letal—LD).

Para determinar la LD50 y la LD de P. aeruginosa PAO1 en G. mellonella, se inyectó en las larvas un inóculo de 10 μl en PBS 1× (101 a 105 UFC/larva). UFC > 104 mataron a todas las larvas antes de las 24 h posteriores a la inoculación. Después de las inyecciones, las larvas se mantuvieron a 37 °C en la oscuridad. La LD50 y la LD se determinaron mediante regresión lineal. Para evaluar la eficacia de los péptidos en G. mellonella infectada con P. aeruginosa se utilizaron 104 y 103 UFC/larvas y el inóculo de la bacteria y las soluciones de péptidos se mezclaron e inmediatamente se inocularon en las larvas (<1 min). Se utilizaron larvas inyectadas con PBS y bacterias como controles negativos y positivos, respectivamente. Las larvas se mantuvieron a 37 °C en la oscuridad y su supervivencia se controló y analizó como se indicó anteriormente. Se utilizó el método de Kaplan-Meier para trazar las curvas de supervivencia. Las diferencias en la supervivencia se calcularon mediante la prueba de rangos logarítmicos utilizando el software R, versión 2.13.0.

Los conjuntos de datos transcriptómicos generados y analizados durante el estudio están disponibles con el número de estudio PRJEB49970 en el Archivo Europeo de Nucleótidos.

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Este proyecto fue posible gracias a la infraestructura financiada por KESS en IBERS, Universidad de Aberystwyth (Reino Unido). Las imágenes de modelado estructural en 3D fueron proporcionadas por el Dr. Narcís Fernández-Fuentes. También nos gustaría agradecer al RCUK Newton Institutional Fund (172629373) y al BBSRC UK (BB/L026716/1).

IBERS, Universidad de Aberystwyth, Aberystwyth, SY23 3DA, Gales, Reino Unido

Adam J. Mulkern, Alan R. Cookson, Toby J. Wilkinson y Luis AJ Mur

TWINCORE, Centro de Investigación de Infecciones Clínicas y Experimentales, una empresa conjunta entre la Facultad de Medicina de Hannover (MHH) y el Centro Helmholtz de Investigación de Infecciones (HZI), Hannover, Alemania

Adam J. Mulkern y Bamu F. Damaris

Instituto para la Seguridad Alimentaria Mundial, 19 Chlorine Gardens, Queen's University de Belfast, Belfast, Irlanda del Norte, BT9 5DP, Reino Unido

Linda B. Oyama, Christopher J. Creevey y Sharon A. Huws

Instituto Roslin y R(D)SVS, Universidad de Edimburgo, Easter Bush, Roslin, Edimburgo, EH25 9RG, Reino Unido

Toby J. Wilkinson

Aix Marseille Univ, CNRS, Centrale Marseille, iSm2, 13397, Marsella, Francia

Hamza Olleik y Marc Maresca

Laboratorio de Genética Molecular de Bacterias, Departamento de Microbiología, Instituto de Biotecnología Aplicada a la Agricultura, Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil

Giarla C. da Silva, Patricia P. Fontes y Denise MS Bazzolli

Departamento de Microbiología, Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, 36570-900, Brasil

Hilario C. Mantovani

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LO, SH y CC concibieron el proyecto. AM, con la ayuda de LO, TW, completó el trabajo de laboratorio bajo la supervisión de SHAC y ayudó a AM con microscopía electrónica de transmisión. AM, HO y MM completaron los ensayos de permeabilización de membrana, citotoxicidad e interacción de lípidos. CC y BD ayudaron a AM con el análisis de datos de RNA-seq. LM ayudó a AM a analizar conjuntos de datos de metabolómica. GS y PF completaron el trabajo in vivo en G. mellonella con la supervisión de DB, HM, LO y SHAM escribieron el artículo con el aporte de todos los coautores.

Correspondencia a Adam J. Mulkern o Sharon A. Huws.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mulkern, AJ, Oyama, LB, Cookson, AR et al. Los péptidos antimicrobianos derivados del microbioma ofrecen soluciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones por Pseudomonas aeruginosa. npj Biofilms Microbiomes 8, 70 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00332-w

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Recibido: 07 de febrero de 2022

Aceptado: 05 de agosto de 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00332-w

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npj Biopelículas y microbiomas (2022)