Alteración de la expresión de proteínas intracelulares como mecanismo clave del deterioro de la desnitrificación bacteriana causado por nanopartículas de óxido de cobre.

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 15824 (2015) Citar este artículo

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La creciente producción y utilización de nanopartículas de óxido de cobre (CuO NP) da como resultado liberaciones al medio ambiente. Sin embargo, rara vez se ha estudiado la influencia de las NP de CuO en la desnitrificación bacteriana, una de las vías más importantes para transformar nitrato en dinitrógeno en el medio ambiente. Aquí informamos que las NP de CuO causaron una alteración significativa de las expresiones proteicas clave de un desnitrificador modelo, Paracoccus denitrificans, lo que llevó a una inhibición severa de la desnitrificación. La eficiencia de eliminación de nitrógeno total disminuyó del 98,3 % al 62,1 % con el aumento de las NP de CuO de 0,05 a 0,25 mg/L. Los estudios de integridad y morfología celular indicaron que las nanopartículas ingresaron a las células. El análisis bioinformático proteómico mostró que las NP de CuO provocaban la regulación de proteínas implicadas en el metabolismo del nitrógeno, la transferencia de electrones y el transporte de sustancias. La regulación negativa de la proteína GtsB (responsable del transporte de glucosa) disminuyó la producción de NADH (donante de electrones para la desnitrificación). Además, las NP de CuO suprimieron las expresiones de proteínas clave de transferencia de electrones (incluidas la NADH deshidrogenasa y el citocromo), lo que afectó negativamente la transferencia de electrones para la desnitrificación. Investigaciones adicionales revelaron que las NP de CuO inhibían significativamente las expresiones y actividades catalíticas de la nitrato reductasa y la nitrito reductasa. Estos resultados proporcionaron una comprensión fundamental de las influencias negativas de las NP de CuO en la desnitrificación bacteriana.

El ciclo del nitrógeno, uno de los principales ciclos biogeoquímicos de la biosfera, logra la transformación del nitrógeno en diferentes formas entre la atmósfera, el agua, la tierra y los organismos. El proceso de desnitrificación, que convierte el nitrato en dinitrógeno y devuelve el elemento nitrógeno a la atmósfera, es de gran importancia por su estrecha relación con el cambio climático global, la calidad del agua y la salud de los ecosistemas1. Como las bacterias desnitrificadoras más ampliamente distribuidas, las bacterias desnitrificantes logran la reducción de nitrato a través de una serie de procesos biológicos. Las reacciones metabólicas desnitrificantes están controladas en última instancia por varias proteínas funcionales, como las proteínas de transferencia de electrones y las enzimas desnitrificantes. Se informó que las expresiones de estas proteínas determinaban el metabolismo celular de los desnitrificantes2,3.

Con el rápido desarrollo de la nanotecnología, los nanomateriales diseñados se han aplicado ampliamente en diversos campos, como la biomedicina, la síntesis de materiales y la catálisis química4,5. Se ha informado que los nanomateriales podrían tener efectos negativos en las células humanas6,7,8, las plantas9 y las bacterias modelo10. En particular, debido a su excelente propiedad antimicrobiana, las nanopartículas de óxido de cobre (CuO NP) se han aplicado ampliamente en textiles antimicrobianos, conservación de madera, pinturas antiincrustantes y biocidas agrícolas11,12. Se informó que la producción mundial de NP de CuO fue de 570 toneladas en 2014 y la producción estimada sería de 1600 toneladas para el año 202513. Por lo tanto, la creciente producción y utilización de NP de CuO resultan en liberaciones intencionales o no intencionales al medio ambiente14. Aunque la toxicidad de las NP de CuO para algunos organismos modelo, como células humanas o algas, había sido ampliamente estudiada15,16, la razón principal se atribuyó a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)4, que podrían conducir a la lesión del ADN o regulación genética9,15. Es bien sabido que las proteínas, productos finales de la expresión genética, son los ejecutores terminales de procesos biológicos específicos, como catalizar reacciones metabólicas y transportar sustancias. Por lo tanto, una vez que las expresiones proteicas se vieran afectadas significativamente, el crecimiento y los procesos metabólicos globales se verían alterados17.

Durante la desnitrificación, la fuente de carbono extracelular (como la glucosa) debe transportarse al interior de las células antes de utilizarse para el crecimiento microbiano y la desnitrificación18,19,20. Está bien documentado que el proceso de transporte de glucosa se logra mediante la cooperación de varias proteínas importantes, como la proteína de unión a solutos (GtsA), la proteína de membrana interna (GtsB y GtsC) y la proteína de unión a ATP (MalK)21. Además, la desnitrificación bacteriana es una serie de reacciones redox secuenciales que dependen de la transferencia de electrones. En la cadena de transferencia de electrones, los electrones son entregados secuencialmente por proteínas de transferencia de electrones como el citocromo bc1, el citocromo cy enzimas desnitrificantes22. Además, cuatro enzimas desnitrificantes clave, la nitrato reductasa (NAR), la nitrito reductasa (NIR), el óxido nítrico reductasa (NOR) y el óxido nitroso reductasa (N2OR), catalizan secuencialmente las reacciones de reducción de nitrato a nitrógeno. Estudios anteriores indicaron que los cambios de las proteínas clave de transporte de electrones o de las enzimas desnitrificantes afectaban el rendimiento de la desnitrificación23,24,25. Sin embargo, rara vez se han documentado las influencias de los nanomateriales diseñados en las expresiones y funciones de proteínas funcionales intracelulares bacterianas desnitrificantes.

En este estudio, se investigaron los efectos potenciales de las NP de CuO sobre la desnitrificación y se exploraron los mecanismos desde el aspecto de la regulación de las expresiones de proteínas intracelulares. Paracoccus denitrificans se encuentra ampliamente en el suelo, el agua y los sedimentos26 y puede llevar a cabo una reducción secuencial de nitrato, nitrito, óxido nítrico y óxido nitroso a gas dinitrógeno27. Así, P. denitrificans ha sido reconocida como una excelente bacteria desnitrificante modelo para determinar los efectos sobre la desnitrificación biológica28. Las influencias de las NP de CuO en la morfología celular y la integridad de la estructura se estudiaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM) y ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Las etiquetas isobáricas para la técnica de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) proporcionaron la información general del proteoma y los análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) clasificaron las proteínas expresadas diferencialmente en funciones y procesos celulares. Los cambios en la regulación de las proteínas intracelulares implicadas en algunas funciones vitales estrechamente relacionadas con la desnitrificación se confirmaron mediante la cuantificación del seguimiento de reacciones múltiples (MRM).

Las bacterias desnitrificantes (como Paracoccus denitrificans en este estudio) emplean una fuente de carbono (como la glucosa) y nitrato, respectivamente, como donador y aceptor de electrones para llevar a cabo el proceso de desnitrificación en circunstancias anaeróbicas, en las que el nitrato se reduce paso a paso a nitrito, óxido nítrico. , óxido nitroso y finalmente nitrógeno22. En este estudio, los efectos de las NP de CuO sobre las variaciones de NO3-, NO2- y N2O se muestran en la Fig. 1. En el control (sin la presencia de NP de CuO), el nitrato se redujo rápidamente y la eficiencia final de eliminación de nitrato fue 98,4%. En presencia de 0,05 mg/L de NP de CuO, la eficiencia de eliminación de nitrato fue del 99,1%, lo que no mostró diferencias significativas con la del control. Sin embargo, con el incremento de las NP de CuO a 0,10 y 0,25 mg/L, la eficiencia de eliminación de nitrato disminuyó a 87,7% y 65,6%, respectivamente.

Efectos de las NP de CuO sobre las variaciones de NO3--N (sólido, A), NO2--N (hueco, A) y N2O-N (B) durante pruebas de exposición de 24 h.

Las barras de error representan desviaciones estándar de mediciones por triplicado.

Aunque se observó un poco de acumulación transitoria de nitrito durante el proceso de desnitrificación, no hubo nitrito detectable a las 24 h en ausencia (el control) y presencia de 0,05 mg/L de NP de CuO. Sin embargo, la concentración final de nitrito fue de 6,94 y 9,54 mg/l con NP de CuO de 0,10 y 0,25 mg/l, respectivamente. En la Fig. 1B se puede ver que la acumulación máxima de N2O disminuyó con el aumento de las NP de CuO, pero no apareció N2O detectable al final de los experimentos, sin importar si las NP de CuO estaban presentes o no. Por lo tanto, los datos de este estudio mostraron que la presencia de NP de CuO condujo a una menor eficiencia de reducción de nitrato y provocó una mayor acumulación de nitrito y menos emisión de N2O durante la desnitrificación. En el siguiente texto, se exploraron las razones por las que las NP de CuO inhiben la desnitrificación.

Por lo general, la toxicidad de las nanopartículas de óxido metálico se atribuyó a la liberación de iones29,30 o al pequeño tamaño de las nanopartículas31. Por lo tanto, se midió el Cu2+ disuelto de las NP de CuO en medios minerales y se investigaron los efectos del control de los iones de cobre sobre P. denitrificans. Los datos de disolución mostraron que la concentración de iones disueltos dependía de la dosis y el tiempo de las NP (Figura S1A, Información complementaria). En detalle, después de 24 h de disolución, se detectaron 0,0069, 0,0115 y 0,0149 mg/L de Cu2+ en el medio para 0,05, 0,1 y 0,25 mg/L de NP de CuO y las proporciones de disolución correspondientes fueron 13,82%, 11,51% y 5,96% respectivamente. Luego, los resultados de la prueba de toxicidad iónica en la Figura S1B (en Información complementaria) indicaron que la presencia de Cu2+ en el rango de 0,0069 (disuelto en 0,05 mg/L de CuO NP) a 0,0149 mg/L (disuelto en 0,25 mg/L de CuO NPs) causaron efectos insignificantes sobre la viabilidad celular de P. denitrificans (p > 0,05). Además, se investigaron los procesos de desnitrificación de P. denitrificans con o sin presencia de iones de cobre (Figura S1C y Figura S1D en Información complementaria) y el Cu2+ no causó efectos significativos en las reducciones de NO3--N y NO2--N. y la concentración final de N2O. Asimismo, la presencia de Cu2+ no inhibió la actividad catalítica de las enzimas desnitrificantes (Figura S2 en Información complementaria). Por lo tanto, el Cu2+ no explica la grave influencia de las NP de CuO en P. denitrificans y en la literatura se llegaron a conclusiones similares9,16. En el próximo texto, el mecanismo tóxico se desarrollará a partir de la interacción entre las NP de CuO y las bacterias.

Estudios anteriores han informado que algunas nanopartículas (como las NP de TiO2) pueden adherirse fácilmente a la superficie celular debido a su propiedad de adsorción, lo que resulta en sus efectos tóxicos32,33. En este estudio, las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) con análisis de espectroscopia de dispersión de energía (EDS) mostraron que las NP de CuO podrían adsorberse en la superficie de P. denitrificans (Fig. 2B). Los datos de la Fig. 2C mostraron que la presencia de NP de CuO provocó la liberación de LDH de P. denitrificans y el nivel de LDH liberada aumentó al aumentar las concentraciones de NP de CuO. Generalmente, la LDH es una enzima estable que se presenta en el citoplasma y su liberación se utiliza como marcador de fuga de la membrana porque la LDH intracelular se liberaría en el cultivo celular si se daña la membrana celular31. En este estudio, la variación de LDH inducida por la exposición a las NP de CuO indicó que las NP de CuO afectaron la integridad de la membrana bacteriana y causaron daño a la membrana. Además, se observó que se inhibieron el crecimiento y la viabilidad de P. denitrificans (Figura S3, Información complementaria). El análisis con microscopio electrónico de transmisión y espectrómetro de dispersión de energía (TEM-EDS) reveló que había NP de CuO dentro de P. denitrificans (Fig. 2E), lo que sugería que las nanopartículas ingresaron a las células.

Efecto de las NP de CuO sobre la estructura celular de P. denitrificans.

Imagen SEM de bacterias (A), imagen SEM y análisis EDS de bacterias expuestas a 0,25 mg/L de NP de CuO (B), liberación de LDH de bacterias expuestas a diferentes dosis de NP de CuO (C), imagen TEM de célula bacteriana sin exposición a NP de CuO (D) e imagen TEM y análisis EDS de células expuestas a 0,25 mg/l de CuO NP (E).

Es bien sabido que grandes cantidades de proteínas en las bacterias son responsables de diversas funciones biológicas. Por ejemplo, la absorción de fuentes de carbono y oligoelementos del entorno extracelular depende de proteínas transportadoras21,34. Para las bacterias desnitrificantes, la reacción de desnitrificación depende en gran medida de las proteínas involucradas en la cadena de transferencia de electrones. Como las NP de CuO han estado dentro de P. denitrificans y el metabolismo celular depende del destino de las proteínas, en el siguiente texto se adoptó un método proteómico basado en la técnica de EM para explorar los mecanismos subyacentes de las NP de CuO que afectan la desnitrificación.

Los datos del análisis iTRAQ mostraron que se identificaron 7976 péptidos únicos y 1449 proteínas. En comparación con el control (células sin exposición a NP de CuO), hubo 138 proteínas expresadas diferencialmente (62 reguladas negativamente y 76 reguladas positivamente) después de la exposición a 0,25 mg / L de NP de CuO durante 24 h. Dado que la anotación de ontología genética (GO) podría proporcionar información importante sobre las proteínas involucradas en el proceso biológico, el componente celular y la función molecular35, en este estudio las 138 proteínas identificadas expresadas diferencialmente se asignaron a los términos GO. La Figura S4 (Información complementaria) mostró que las proteínas expresadas diferencialmente estaban relacionadas principalmente con la actividad catalítica, la unión y la actividad transportadora a nivel de función molecular. Con base en los procesos metabólicos en los que estuvieron involucradas varias proteínas, los resultados de la anotación de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) indicaron que la mayoría de las proteínas expresadas diferencialmente inducidas por NP de CuO se clasificaron en el transportador del casete de unión de ATP (ABC) (Figura S5 , Información suplementaria). Las proteínas relacionadas con este proceso formaban una de las familias de proteínas más grandes con diversas funciones fisiológicas. Aparentemente, la presencia de NP de CuO influyó en el proceso metabólico celular, como las reacciones catalíticas y el transporte.

Para comprender mejor las respuestas celulares subyacentes desencadenadas por las NP de CuO, se utilizó el algoritmo STRING (herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes) para construir redes de interacción proteína-proteína. Las proteínas expresadas diferencialmente inducidas por 0,25 mg / L de NP de CuO se muestran en la Fig. 3 y las líneas representan las relaciones de interacción de varias proteínas. Las proteínas fueron identificadas y clasificadas por funciones biológicas específicas y quedó claro que el metabolismo del nitrógeno, la transferencia y el transporte de electrones eran tres funciones predominantes que se veían afectadas porque la mayoría de las proteínas diferenciales reguladas pertenecían a estas categorías. Para las bacterias desnitrificantes, el proceso de desnitrificación dependía del metabolismo del nitrógeno, por lo que las expresiones afectadas de proteínas en esta categoría podrían tener una influencia directa en el rendimiento de la desnitrificación. Además, la transformación de nitrato a dinitrógeno fue una serie de reacciones de reducción secuenciales, que requirieron la participación de la transferencia de electrones. Es razonable que la transferencia de electrones estuviera estrechamente asociada con la transformación del nitrógeno y esta fuerte interacción también se observó en la red (Fig. 3). Además, las proteínas transportadoras, que desempeñan la función de transportar sustancias (como sustancias nutrientes e iones) para el crecimiento y la desnitrificación, exhibieron expresiones diferenciales bajo estrés de CuO NP. Por lo tanto, la exposición a las NP de CuO indujo la regulación de las proteínas metabólicas del nitrógeno, las proteínas de transferencia de electrones y las proteínas de transporte, lo que perturbaría la desnitrificación directa o indirectamente.

La red de interacción de proteínas diferenciales inducida por CuO NP.

La red fue creada mediante el algoritmo STRING y las interacciones fuertes están representadas por líneas más gruesas.

La Figura S6 (Información complementaria) ilustra que la glucosa (fuente de carbono) se transporta primero a las bacterias mediante proteínas de membrana transportadoras ABC de carbohidratos, incluida la proteína de unión a solutos extracelular (GtsA), la proteína de membrana interna del sistema de transporte dependiente de proteínas de unión (GtsB, GtsC) y sistema de transporte proteína fijadora de ATP (MalK)34. Luego, la glucosa intracelular pasa por un proceso de glucólisis y se degrada con la generación de NADH (el donante directo de electrones) para su posterior desnitrificación. La Figura 4A revela que el nivel de expresión de GtsB fue del 80% del control y la regulación negativa se verificó mediante la cuantificación MRM. La Figura 4B muestra además que la utilización de glucosa disminuyó con el aumento de la dosis de CuO NP, es decir, de 1,96 (control) a 1,80 (0,10 mg/L de CuO NP) y 1,58 g/L (0,25 mg/L de CuO NP). Después de que la glucosa se transporta a las bacterias, se degrada y se genera NADH. Se puede ver en la Figura S7 (Información complementaria) que las expresiones de las enzimas involucradas en el proceso de glucólisis no se vieron afectadas, lo que sugiere que la exposición a las NP de CuO no perturbó la degradación de la glucosa. Sin embargo, los datos de la Fig. 4C indicaron que el nivel de NADH intracelular disminuyó significativamente con NP de CuO superiores a 0,05 mg/l y el efecto inhibidor se magnificó con el aumento de la dosis. Por lo tanto, la inhibición de las proteínas transportadoras de glucosa condujo a una menor disponibilidad de glucosa para el metabolismo intracelular bacteriano, lo que se atribuyó además a la disminución de la generación de NADH.

Expresiones relativas de proteínas transportadoras de glucosa de bacterias desnitrificantes (A), utilización de glucosa en ausencia y presencia de NP de CuO (B) y nivel relativo de NADH intracelular de P. denitrificans después de la exposición a NP de CuO (C).

En el proceso de desnitrificación, grandes cantidades de metaloproteínas (como el citocromo, la deshidrogenasa y la reductasa) contienen un átomo de hierro, que actúa como centro activo para las reacciones redox. Se ha informado que las células de P. denitrificans adquieren hierro para la síntesis de metaloproteínas a partir de circunstancias extracelulares a través de las proteínas de captación de hidroxamato férrico (Fhu), que consisten en la proteína de unión al sustrato FhuD, la proteína de permeasa FhuB y la proteína de unión a ATP FhuC (Fig. 5A). Debido a que la síntesis de proteínas vitales contenidas en hierro dependía del transporte celular de hierro38, se investigó la influencia de las NP de CuO en las expresiones de las proteínas transportadoras de hierro. El nivel de expresión de la proteína FhuD bajo un estrés de 0,25 mg/l de NP de CuO fue del 60,6 % del control, lo que indica que las NP de CuO causaron una regulación negativa significativa de la proteína transportadora de hierro. La inhibición de la absorción de hierro se verificó aún más mediante la cuantificación del hierro intracelular y las NP de CuO redujeron significativamente el hierro disponible intracelular, ya que la intensidad de fluorescencia media emitida por la sonda de unión al hierro disminuyó de 4660 (el control) a 1903 (en presencia de 0,25 mg/L de CuO). NP) en la Fig. 5B.

Ilustración del transporte de hierro y sus funciones en la síntesis de proteínas Fe-S en P. denitrificans (A), la distribución de la intensidad de fluorescencia de la sonda de unión al hierro en bacterias sin tratamiento con NP de CuO (el panel superior) y expuestas a 0,25 mg/L de CuO NP (el panel inferior) mediante análisis de citometría de flujo (B).

Como se ilustra en la Fig. 6A, en el proceso de transferencia de electrones, los donantes de electrones son catalizados por la NADH deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa y los electrones generados se entregan a la ubiquinona, el complejo citocromo bc1 y finalmente se transfieren a enzimas desnitrificantes clave a través del citocromo c22,39. Para comprender en profundidad cómo las NP de CuO afectan la desnitrificación, se investigó el destino de las proteínas involucradas en el proceso de transferencia de electrones. Se puede ver en la Fig. 6B que la presencia de NP de CuO afectó significativamente a varias proteínas en la cadena de transferencia de electrones. Las expresiones de dos subunidades de NADH deshidrogenasa (es decir, NADH flavin oxidorreductasa y subunidad alfa de flavoproteína de transferencia de electrones) en presencia de 0,25 mg/l de NP de CuO fueron, respectivamente, 78,8% y 88,6% del control. Las expresiones de citocromo c, citocromo c1, ubiquinol-citocromo c reductasa subunidad hierro-azufre y SCO1/SenC fueron 53,5%, 84,4%, 85,7% y 66% del control respectivamente, y todos mostraron una regulación negativa cuando se expusieron a NP de CuO. . Claramente, la presencia de NP de CuO indujo expresiones reguladas negativamente de proteínas clave involucradas en la cadena de transferencia de electrones, lo que resultó en una baja eficiencia de transferencia de electrones para reacciones de desnitrificación posteriores.

Ilustración de la transferencia de electrones y la transformación de sustancias en el proceso de desnitrificación (A), el nivel de expresión relativo de las proteínas involucradas en la desnitrificación (B), los efectos de la exposición a las NP de CuO en las actividades de NAR, NIR, NOR y N2OR en el tiempo de 24 h ( C).

Las barras de error representan desviaciones estándar de mediciones por triplicado y los asteriscos indican una reducción significativa en comparación con las muestras de control (p <0,05).

Después de ser transferidos por un transportador de electrones, los electrones se entregan a enzimas desnitrificantes específicas para reacciones de reducción. En las reacciones de desnitrificación, la NAR asume la función de reducir el nitrato y esta enzima comprende tres subunidades (α, β y γ)40. Los electrones se transfieren de la subunidad γ a la subunidad β y finalmente a la subunidad α, el sitio activo para la reducción de nitrato. La Figura 6B muestra que tanto las expresiones de la subunidad α como de la subunidad β de NAR disminuyeron al 84,7% y al 82,5% del control en presencia de NP de CuO y las pruebas de viabilidad enzimática confirmaron la menor actividad catalítica de NAR inducida por NP de CuO. (Figura 6C). Mientras tanto, la expresión de nitrito reductasa se reguló negativamente en un 29,2% y en la Fig. 6C se muestra un patrón decreciente similar de actividad NIR. Estos resultados estaban en correspondencia con las observaciones de las NP de CuO que inducían una mayor acumulación de nitrato y nitrito. Además, las NP de CuO indujeron una expresión regulada positivamente (167%) y elevaron la actividad de la óxido nitroso reductasa, lo que se atribuyó a la liberación de trazas de Cu2+ (0,016 mg/l) a partir de 0,25 mg/l de NP de CuO, ya que su presencia era mayor. Se informó que está a favor de la actividad catalítica del N2OR41,42. Estos datos explicaron el fenómeno de que la acumulación máxima de N2O descendió con el incremento de la dosis de NP de CuO (Fig. 1B).

En resumen, la presencia de NP de CuO podría causar efectos significativos sobre la función de desnitrificación de P. denitrificans, como una menor reducción de nitrato, una mayor acumulación de nitrito y una menor acumulación máxima de óxido nitroso. La membrana dañada condujo a la entrada de NP de CuO en las bacterias y luego la alteración proteómica fue inducida por NP de CuO intracelulares. El análisis bioinformático indicó que algunas funciones o vías metabólicas vitales, como el transporte de sustancias, la transferencia de electrones y la actividad catalítica, se vieron afectadas significativamente por las NP de CuO. Específicamente, las proteínas transportadoras de glucosa estaban reguladas negativamente, lo que llevó a una menor cantidad de NADH donante de electrones para la desnitrificación. Además, la restricción en la absorción de hierro resultó en una menor disponibilidad de hierro, lo que fue adverso para la síntesis y función de las proteínas contenidas en hierro en el proceso de desnitrificación. En la cadena de transferencia de electrones, varias proteínas importantes de transferencia de electrones y enzimas desnitrificantes también se vieron afectadas por las NP de CuO y las mediciones de la actividad enzimática de acuerdo con la regulación negativa de NAR y NIR y la regulación positiva de N2OR. Todas estas observaciones estaban en correspondencia con la disminución del rendimiento de desnitrificación inducida por las NP de CuO.

Las NP de CuO (tamaño de partícula <50 nm) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El análisis de difracción de rayos X (DRX) se realizó en un difractómetro Bruker D8 Advance con una fuente de radiación Cu Kα y el resultado se muestra en la Figura S8 (Información complementaria). Las NP de CuO en polvo se sometieron a ultrasonidos en alcohol y luego se colocaron en rejillas de Ni para el análisis TEM (Figura S9, Información complementaria). Además, la suspensión madre de NP de 50 mg/l se preparó dispersando 0,05 g de polvo de NP en 1 litro de agua Milli-Q, seguido de 1 h de ultrasonicación (25 °C, 500 W, 40 kHz). La distribución del tamaño de las partículas en suspensión madre se determinó mediante la técnica de difracción láser mediante un Mastersizer 3000 (Malvern Reino Unido).

La cepa de Paracoccus denitrificans (ATCC 19367) está apareciendo ampliamente en ambientes acuáticos y suelos y el mecanismo metabólico se comprende bien para la investigación22. En este estudio, se empleó Paracoccus denitrificans como microbio desnitrificante de prueba, que se adquirió de la American Type Culture Collection. Antes de la exposición a las NP de CuO, P. denitrificans se cultivó aeróbicamente en caldo nutritivo Difco a 30 °C en un agitador con agitación constante (200 rpm) durante 24 h. Luego, las bacterias se recogieron de los medios de caldo para las siguientes pruebas de exposición.

En primer lugar, se preparó medio mineral en frascos de suero y la composición fue la de referencia con modificación menor (g/L): glucosa, 5,0; K2HPO4, 7,0; KH2PO4, 3,0; citrato de sodio·2H2O, 0,5; MgSO4·7H2O, 0,1; (NH4)2SO4, 1,0; KNO3, 2,16 y solución de oligoelementos de 50 μL/L28. La solución de oligoelementos contenía (g/L): CaCl2·2H2O, 7,4; MnSO4·H2O, 1,0; ZnSO4·7H2O, 3,6; CoCl2·6H2O, 0,4; FeCl3·6H2O, 0,96; CuCl2·2H2O, 0,03; H3BO3, 0,3; NiCl2·6H2O, 0,01; EDTA-Na2, 3.7. Según la referencia, se utilizó sulfato de amonio para impedir la reducción por asimilación de nitrato y garantizar que el consumo de nitrato fuera causado por la respiración23. Todos los frascos de suero y equipos correlativos se esterilizaron en un recipiente de esterilización con vapor de alta presión y luego se desinfectaron con rayos ultravioleta durante 20 minutos. En una cámara anaeróbica, se añadió una suspensión madre de CuO NP al medio mineral y luego se inocularon cultivos bacterianos a un valor de densidad óptica inicial (OD600) de 0,05. Después de una buena preparación, los frascos de suero se colocaron en un agitador (200 rpm) con temperatura constante de 30 ± 1 °C y las muestras se tomaron para análisis cada 4 h.

Después de exponerlas a 0 o 0,25 mg/L de NP de CuO durante 24 h, se obtuvieron muestras por triplicado de cada botella de suero y luego se mezclaron para la prueba iTRAQ. Los sedimentos de bacterias se obtuvieron primero mediante centrifugación a 5000 rpm. Después de la adición del tampón STD preparado (que contiene dodecilsulfato de sodio (SDS) al 4% y Tris-HCl 150 mM (pH 8,0)), las muestras se trataron mediante mezcla en vórtice, calentamiento en agua durante 5 minutos y disrupción sónica (80 W). , 10 s de funcionamiento y 15 s de pausa para 10 ciclos). Finalmente, el sobrenadante se recogió mediante centrifugación (4 °C, 15000 rpm, 10 min) después de calentar el agua por lotes y se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Lowry et al.43.

Las proteínas extraídas fueron digeridas según la referencia44. Brevemente, se diluyeron 400 μg de proteína de cada muestra en 30 μl de tampón STD (SDS al 4%, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) y ditiotreitol 100 mM). Luego, la solución se incubó en agua hirviendo durante 5 minutos, se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con 200 µl de tampón UA (urea 8 M, Tris-HCl 150 mM (pH 8,0)) y se transfirió a un filtro de 10 kD para ultrafiltración. Las muestras se centrifugaron a 14000 g durante 15 min (4 °C), se les añadió 200 μl de tampón UA y se centrifugaron nuevamente. Después de agregar 100 μl de yodoacetamida (50 mM en tampón UA), las muestras se colocaron en oscuridad durante 20 min, se centrifugaron en las condiciones anteriores y se lavaron con tampón UA dos veces. Se agregaron 10 µl de tampón DS (bicarbonato de trietilamonio 50 mM, pH 8,5) a las muestras y luego se centrifugaron (14000 g durante 15 minutos a 4 °C). Esta operación se repitió dos veces. Finalmente, se agregaron 40 μL de tripsina (5 μg de tripsina en 40 μL de tampón DS) y las muestras se incubaron a 37 °C durante 16 h. Los péptidos resultantes se recogieron en tubos nuevos antes de la centrifugación y el contenido de péptido se midió a 280 nm.

Después de la digestión, se marcaron 80 μg de péptido con reactivos iTRAQ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, EE. UU.). Las muestras n.° 1 (sin exposición a NP de CuO) y n.° 2 (con exposición a NP de CuO a 0,25 mg/l) se hicieron reaccionar respectivamente con los reactivos 114 y 115 y luego se mezclaron las muestras marcadas y se llevó 1/5 de la mezcla a desalinización con un cartucho C18. (Sigma) antes de secarse al vacío.

El proceso de separación se realizó mediante el sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con nanobomba Easy nLC. La columna se equilibró con tampón A al 95 % (v/v) (ácido fórmico al 0,1 % (v/v)) y luego las muestras se inyectaron en dos columnas Thermocientific EASY (2 cm x 100 μm, 5 μm-C18; 75 μm × 100 mm 3 μm-C18) sucesivamente con un caudal de 250 nL/min. Los péptidos se separaron con tampón B (0,1% de ácido fórmico y 84% de acetonitrilo en agua MilliQ) de acuerdo con el siguiente gradiente segmentado: 0–55% durante 220 min, 55%–100% durante 8 min y finalmente 100% durante 12 min.

Después de la separación, las muestras se analizaron con un espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Finnigan, EE. UU.) (con un rango de masa de 300 a 1800 m/z) en el modo de iones positivos durante 240 minutos. Los escaneos de encuesta se adquirieron con una resolución de 70000 para el escaneo MS y 17500 para el escaneo MS/MS a m/z 200, con una ventana de aislamiento de 1,6 m/z. Los tiempos máximos de inyección de iones fueron 10 y 60 ms para MS y MS/MS, respectivamente, y el objetivo del control automático de ganancia (AGC) se estableció en 3E6. Otros parámetros fueron los siguientes: exclusión dinámica 40 s, índice de subllenado 0,1% y energía de colisión 30 eV.

Los datos sin procesar de los espectros MS/MS se procesaron utilizando Mascot 2.2 y Proteome Discoverer 1.4 para búsqueda en bases de datos y análisis cuantitativo. Los parámetros MASCOT se establecieron de la siguiente manera: tolerancia de masa de péptidos, 20 ppm; tolerancia de masa de fragmentos, 0,1 Da; escisiones máximas perdidas, 2. Todos los datos se basaron en al menos un péptido único con un 99 % de confianza y la identificación de proteínas se determinó mediante una tasa de descubrimiento falso (FDR) ≤1 % como umbral de detección para el péptido después del análisis espectrométrico de masas y la búsqueda de mascotas en la base de datos45.

De acuerdo con los resultados de iTRAQ, se seleccionaron y cuantificaron varias proteínas clave expresadas diferencialmente (consulte la Tabla S1, Información complementaria) mediante monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Para el análisis MRM, los requisitos básicos de los péptidos seleccionados fueron los siguientes: longitud de 10 a 15 aminoácidos, péptido único de proteínas diferenciales, sin modificación de proteínas postraduccional (como oxidación de metionina y alquilación de cisteína) y números de recuento altos en las pruebas iTRAQ. Se utilizó el factor de iniciación de la traducción de proteínas IF-2 como estándar interno. En resumen, después de la separación por HPLC, el análisis de MS de las muestras se realizó utilizando el sistema AB SCIEX QTRAP 5500 interconectado con la fuente Nanospray III y se realizaron ensayos de LC-MS/MS por triplicado para cada muestra. Los parámetros para el análisis de MS fueron los siguientes: modo de iones positivos durante 60 min, rango de masa de 100 a 1000 m/z y tolerancia de masa de 250 mDa. Los datos de cuantificación sin procesar se confirmaron mediante el software AB SCIEX ProteinPilot 4.5 con una restricción de confianza> 0,95 y la intensidad de la transición del péptido se analizó cuantitativamente mediante el software Skyline 2.5.0 (Universidad de Washington). Se utilizaron muestras biológicas triplicadas en la prueba de cuantificación MRM y se consideró que las proteínas expresadas diferencialmente estaban significativamente reguladas en comparación con el control cuando p <0,05.

Para la medición de la actividad enzimática se prepararon primero los extractos celulares brutos. Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos, se lavaron dos veces con PBS 100 mM (pH 7,4) y se resuspendieron en el mismo tampón. La suspensión se rompió mediante sonicación a 20 KHz durante 5 minutos y luego los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 12000 rpm durante 10 minutos. Los extractos celulares brutos preparados se utilizaron inmediatamente para la determinación de actividades enzimáticas específicas. Todas las operaciones anteriores se llevaron a cabo a 4 °C. Las actividades enzimáticas se basaron en el contenido de proteínas y el contenido de proteínas se determinó mediante el método de Lowry et al. con albúmina sérica bovina como estándar43.

La mezcla de ensayo para las reacciones contenía tampón PBS 10 mM (pH 7,4), viológeno de metilo 1 mM, Na2S2O4 5 mM y sustrato de reacción 1 mM (KNO3, NaNO2, NO o N2O). La reacción se inició añadiendo 0,3 ml de extractos celulares crudos y la mezcla se depositó inmediatamente en una incubadora a 30 °C. Los datos se recogieron cada 10 minutos en un espectrofotómetro (para NAR y NIR, Shimazu UV1800, Japón) o microsensores (para NOR y N2OR, Unisense, Dinamarca). Finalmente, sus actividades se calcularon como μmol de sustrato/(min·mg de proteína).

Según la literatura, el hierro intracelular se determinó mediante la sonda de fluorescencia calceína-AM (calceína-acetometoxi)46,47. La calceína-AM permeante puede ingresar a las células, unirse al hierro intracelular y existir en la forma de unión al hierro [CA-Fe], que emite fluorescencia a una excitación de 488 nm. En primer lugar, las células bacterianas se obtuvieron centrifugando a 3500 rpm durante 10 minutos y luego se lavaron con tampón HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico) (HEPES 20 mM, NaCl 153 mM, KCl 5 mM, KCl 5 mM). glucosa, pH 7,4) tres veces. Para el etiquetado con tinte, las células se ajustaron a 1 x 107 células/ml en tampón HEPES con calceína-AM 0,5 μM durante 30 minutos de incubación a 37 °C. Luego, las células se enjuagaron con tampón HEPES para eliminar la calceína-AM extracelular y luego se cargaron en una placa de 96 pocillos con el mismo tampón para la detección de fluorescencia. El análisis de citometría de flujo se realizó con un BD Accuri C6 (EE. UU.) utilizando un láser de iones de argón de 488 nm y las emisiones de fluorescencia se hicieron pasar a través de un filtro de banda ancha de 530/30 nm. Durante el proceso de detección, se recogieron 10.000 células y se midieron las intensidades de fluorescencia para su análisis.

Las concentraciones de NO3- y NO2- se determinaron mediante un espectrofotómetro de acuerdo con los métodos estándar48 y la glucosa se midió mediante el método de antrona-H2SO449. La determinación de N2O se realizó mediante un cromatógrafo de gases (GC) (Agilent 7820A, EE. UU.) con un detector de captura de electrones (ECD). El N2O en el gas se tomó una muestra directamente y se inyectó en la entrada de muestra del GC mediante una jeringa y el N2O disuelto en una solución acuosa se detectó después de usar un espacio de cabeza con una temperatura y un tiempo de equilibrio de 25 °C y 3 h, respectivamente. La densidad óptica (OD600) de la suspensión bacteriana se midió utilizando un espectrofotómetro (Shimadzu UV1800, Japón) a 600 nm cada 4 h.

El ensayo de liberación de LDH se utilizó para determinar la integridad de la membrana para que la LDH intracelular se liberara al medio extracelular si la membrana celular estuviera dañada31. El kit de detección de citotoxicidad se adquirió de Roche Applied Science y la mezcla de reacción se preparó según las instrucciones del fabricante. Después de exponerlos a NP de CuO durante 24 h, los sobrenadantes del cultivo se obtuvieron mediante centrifugación (12000 rpm durante 3 min) y se sembraron en una placa de 96 pocillos y luego se agregaron 50 μL de la mezcla de reacción durante 30 min de incubación a 30 °C. Finalmente, los datos se obtuvieron a una absorbancia de 490 nm mediante un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.). La viabilidad celular se detectó mediante Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En detalle, se obtuvieron 100 μL de las suspensiones celulares después de 24 h de exposición y se colocaron en una placa de 96 pocillos, luego se sembraron 10 μL de CCK-8 durante 30 minutos a 30 °C. Posteriormente, se registró la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.).

Se utilizaron imágenes SEM para obtener la morfología de la superficie de las bacterias tratadas con NP de CuO y el procedimiento de preparación de las muestras se documentó en la literatura50,51,52. Después de 24 h de exposición a NP de CuO, las células bacterianas se fijaron con glutaraldehído al 2, 5% durante 2 h, se lavaron 3 veces con una solución tampón de fosfato 0, 1 M (PBS, pH 7, 4) y luego se secaron en un liofilizador al vacío. Finalmente, las muestras secas se recubrieron con oro y luego se observaron en un SEM FEI Quanta 200 a 20 kV equipado con espectroscopía de dispersión de energía (EDS). Se empleó TEM para investigar la presencia intracelular de NP de CuO y las muestras se prepararon de acuerdo con la literatura16,53. Las bacterias tratadas se fijaron con glutaraldehído al 2,5% durante 2 h, se fijaron posteriormente en ácido ósmico al 1% durante 1 h, se lavaron con solución tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) 3 veces y se deshidrataron en una concentración creciente de acetona (30%, 50% , 70%, 90% y 100%) durante 20 min cada vez. Luego, las muestras se permearon e impregnaron con resina pura durante 5 h a 60 °C y se realizaron secciones ultrafinas de 60 nm para su posterior obtención de imágenes con un Tecnai G2 (FEI, EE. UU.) con un voltaje de aceleración de 120 kV.

La medición del NADH intracelular se realizó según la literatura54. Las muestras se obtuvieron por centrifugación a 15000 rpm durante 1 min y se agregaron 300 μL de NaOH 0,2 M para resuspender los sedimentos. Luego, las muestras se colocaron en un baño de agua a 50 °C durante 10 minutos, se enfriaron a 0 °C en hielo y se neutralizaron agregando 300 μL de HCl 0,1 M gota a gota mientras se agitaba con vórtex. Después de la centrifugación a 15000 rpm durante 5 minutos, se utilizaron los sobrenadantes para la siguiente medición. La mezcla de ensayo contenía volúmenes iguales de tampón Bicina 1,0 M (pH 8,0), etanol, EDTA 40 mM (pH 8,0), azul de tiazolilo (MTT) 4,2 mM y el doble del volumen de etosulfato de fenazina (PES) 16,6 mM y luego se incubó a 30ºC. ºC durante 10 min. La mezcla de reacción se preparó en los siguientes volúmenes: 50 µl de extracto celular neutralizado, 0,3 ml de agua destilada y 0,6 ml de mezcla de ensayo. La reacción se inició añadiendo 50 μL de alcohol deshidrogenasa (ADH, 500 U/mL) y luego se registró la absorbancia a 570 nm a 30 °C. Las concentraciones de NADH se calibraron con soluciones estándar de NADH y los niveles intracelulares finales de NADH se calcularon en función del contenido de proteínas.

Todas las pruebas se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) para probar la significancia de los resultados y se consideró estadísticamente significativo p <0,05.

Cómo citar este artículo: Su, Y. et al. Alteración de la expresión de proteínas intracelulares como mecanismo clave del deterioro de la desnitrificación bacteriana causado por nanopartículas de óxido de cobre. Ciencia. Rep. 5, 15824; doi: 10.1038/srep15824 (2015).

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias de China (51425802, 41301558 y 51578394), el Programa del Científico Jefe de la Materia de Shanghai (15XD1503400) y el Centro de Innovación Colaborativa para la Calidad Ambiental Regional.

Laboratorio Estatal Clave de Control de la Contaminación y Reutilización de Recursos, Facultad de Ingeniería y Ciencias Ambientales, Universidad de Tongji, 1239 Siping Road, Shanghai, 200092, China

Yinglong Su, Xiong Zheng, Yinguang Chen, Mu Li y Kun Liu

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YS, XZ e YC concibieron y diseñaron los experimentos. YS, XZ, ML y KL realizaron los experimentos. YS, XZ, YC y ML analizaron los datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y revisaron el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Su, Y., Zheng, X., Chen, Y. et al. Alteración de la expresión de proteínas intracelulares como mecanismo clave del deterioro de la desnitrificación bacteriana causado por nanopartículas de óxido de cobre. Representante científico 5, 15824 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15824

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Recibido: 23 de abril de 2015

Aceptado: 01 de octubre de 2015

Publicado: 28 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15824

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