La oxidación anaeróbica de tiosulfato por parte del grupo Roseobacter prevalece en las biopelículas marinas

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2033 (2023) Citar este artículo

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La oxidación del tiosulfato por parte de microbios tiene un impacto importante en el ciclo global del azufre. Aquí, proporcionamos evidencia de que las bacterias dentro de varios linajes de Roseobacter son importantes para la oxidación de tiosulfato en biopelículas marinas. Aislamos y secuenciamos los genomas de 54 cepas de Roseobacter asociadas a biopelículas, encontrando grupos de genes sox conservados para la oxidación de tiosulfato y plásmidos, lo que apunta a un estilo de vida específico de un nicho. El análisis de los datos metagenómicos de los océanos globales sugiere que las cepas de Roseobacter abundan en biopelículas y esteras en diversos sustratos, incluidas piedras, superficies artificiales, raíces de plantas y chimeneas de respiraderos hidrotermales. El análisis metatranscriptómico indica que la mayoría de los genes sox activos en las biopelículas pertenecen a cepas de Roseobacter. Además, demostramos que las cepas de Roseobacter pueden crecer y oxidar el tiosulfato a sulfato tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Los análisis transcriptómicos y proteómicos de membrana de biopelículas formadas por una cepa representativa indican que el tiosulfato induce la expresión del gen sox y alteraciones en la composición de las proteínas de la membrana celular, y promueve la formación de biopelículas y la respiración anaeróbica. Proponemos que las bacterias del grupo Roseobacter son los principales oxidantes de tiosulfato en las biopelículas marinas, donde se prefiere el metabolismo anaeróbico del tiosulfato.

El ciclo de compuestos inorgánicos de azufre por parte de microbios es un importante progreso biogeoquímico. La transformación del azufre implica el tiosulfato como intermediario, que abunda en ambientes marinos1,2. Es bien sabido que las bacterias oxidantes de azufre incluyen diversas bacterias autótrofas de varios grupos, como SUP05, SAR324, BS-GSO2 y Chlorobi3. Estas bacterias emplean la vía multienzimática sox para la oxidación del tiosulfato4,5 y pueden crecer de forma autótrofa utilizando el tiosulfato como donante de electrones para la producción de energía6. Los productos finales de la oxidación del tiosulfato difieren entre diferentes bacterias, ya que ciertas bacterias organotróficas obligadas (p. ej., Pseudomonas stutzeri y Catenocossus thiosyclus) oxidan el tiosulfato de forma incompleta a tetrationato, mientras que otras heterótrofas (p. ej., Bosea thiooxidans y Limnobacter thiooxidans) oxidan el tiosulfato a sulfato, el forma más oxidada del azufre, en una vía similar común entre las bacterias autótrofas oxidantes del azufre7. El sistema de enzima oxidante de azufre (SOX), un sistema multienzimático periplásmico típico, que se encontró por primera vez en la bacteria litoautótrofa Paracoccus pantotrophus5,8, es el mediador más conocido de la oxidación de tiosulfato. Con respecto a la utilización de aceptores de electrones y la distribución de nichos, se han aislado oxidantes de tiosulfato aeróbicos del máximo profundo de clorofila9, agua de mar costera10 y sedimentos marinos costeros11, mientras que recientemente se han reportado oxidantes de tiosulfato anaeróbicos en cuencas marinas anóxicas12, zonas mínimas de oxígeno oceánico13 y respiraderos hidrotermales14. Además, las condiciones ambientales afectan a los principales productos de la producción de tiosulfato. Por ejemplo, en los sedimentos marinos costeros, el tiosulfato se oxida a proporciones variables de tetrationato y sulfato, así como azufre elemental, dependiendo de las condiciones sulfídicas y oxigenadas11.

Como nicho importante para muchos microbios, las biopelículas constituyen el 40% de la biomasa microbiana del océano15. Muchos microbios forman biopelículas cuando comienzan a adherirse a cualquier superficie sumergida en agua, como materiales artificiales, superficies rocosas, pieles de animales y nieve marina15,16. Una comunidad de biopelícula marina puede estar compuesta por cientos de especies microbianas y estructuralmente la biopelícula se caracteriza por la heterogeneidad en términos de concentración estratificada de oxígeno, nutrientes y moléculas de señalización17. Nuestros estudios recientes18,19 sugirieron que las biopelículas marinas constituyen un banco de taxones y funciones desconocidos, que contienen más de 7000 especies bacterianas que de otro modo no se encontrarían en la microbiota del agua de mar. Además, se informa que las biopelículas marinas participan en importantes procesos biogeoquímicos, como la conversión de materia orgánica disuelta, la remineralización de partículas y el paso de nutrientes de las aguas superficiales a los océanos profundos20. Sin embargo, probablemente debido a las complejas estructuras físicas de la comunidad y a las composiciones taxonómicas, la oxidación de tiosulfato en biopelículas marinas sigue siendo en gran medida desconocida, particularmente en relación con las contribuciones de diferentes taxones y sus características metabólicas relevantes. Las preguntas específicas son qué bacterias contribuyen más a la oxidación del tiosulfato en las biopelículas marinas y cómo llevan a cabo este proceso.

Las bacterias del grupo Roseobacter (o la familia Roseobacteraceae21), que comparten > 89% de identidad en el gen 16 S rRNA, son heterótrofas que se encuentran en los ecosistemas marinos de todo el mundo. El grupo Roseobacter descubierto hasta ahora comprende 327 especies y 128 géneros21, representados por Ruegeria (por ejemplo, Ruegeria pomeroyi DSS-322, una cepa modelo), Phaeobacter (cepas bien conocidas por la producción de ácido tropoditiético23), Sulfitobacter (cepas ampliamente distribuidas en el océano global24), y Loktanella (adaptada a las regiones polares25). Se informa que ciertas cepas de Roseobacter están asociadas con biopelículas en superficies de algas, invertebrados y partículas marinas, aunque la mayoría de las cepas aisladas de Roseobacter son de vida libre. Por ejemplo, los análisis de los datos del océano Tara sugirieron que las cepas de Ruegeria mobilis ocurren en el 40 y el 6% de las muestras de la fracción asociada a partículas y la fracción de vida libre, respectivamente26, lo que implica su preferencia por un estilo de vida asociado a biopelículas. Fisiológicamente, las cepas de Roseobacter son a menudo conocidas por su versatilidad metabólica, que implica principalmente oxidación de monóxido de carbono, degradación de compuestos aromáticos, producción metabólica secundaria y oxidación de compuestos de azufre27,28,29. Los genomas de varias cepas aisladas de Roseobacter contienen genes sox, aunque su capacidad para oxidar el tiosulfato no se ha demostrado experimentalmente. Además, como la oxidación del tiosulfato se ve afectada por la disponibilidad de aceptores de electrones, es posible que el gradiente de oxígeno en las biopelículas promueva el desarrollo de nuevas bacterias oxidantes de tiosulfato.

Aquí planteamos la hipótesis de que las cepas de Roseobacter representan importantes oxidantes de tiosulfato en biopelículas marinas. Para probar esta hipótesis, estudiamos sistemáticamente el papel de las cepas de Roseobacter en la oxidación de tiosulfato en biopelículas oceánicas globales, comenzando con el aislamiento y la detección bacteriana a gran escala. Se predijeron las características metabólicas de 54 nuevas cepas de Roseobacter aisladas de biopelículas marinas mediante la secuenciación completa del genoma. La distribución y actividad in situ fueron exploradas mediante metagenómica y metatranscriptómica. Además, los experimentos fisiológicos y bioquímicos, la transcriptómica y la proteómica demostraron una especificidad de nicho significativa en la oxidación bacteriana del tiosulfato.

Aislamos y cultivamos cepas bacterianas a partir de biopelículas en rocas naturales sumergidas en aguas costeras. Después de análisis preliminares de las secuencias del gen 16S rRNA generadas por la secuenciación de Sanger, se identificaron más de 500 cepas no redundantes, incluidas 54 cepas distantes afiliadas a Roseobacter (en lo sucesivo denominadas cepas de Roseobacter de biopelícula). Luego, se secuenciaron los genomas completos de las 54 cepas mediante la técnica de secuenciación PacBio. La información básica basada en análisis genómicos, incluidos los números de acceso, los tamaños del genoma, el contenido de GC, la cantidad de plásmidos, la cantidad de marcos de lectura abiertos (ORF) y la cantidad de genes de ARNr y ARNt, se proporciona en los Datos complementarios 1. Clasificación taxonómica basada en La búsqueda del genoma completo en la base de datos GTDB-TK30 dividió las 54 cepas en nueve géneros, incluidos Alliroseovarius, Jannaschia, Leisingera, Phaeobacter, Roseicyclus, Ruegeria, Sulfitobacter, Yoonia y un género potencialmente nuevo representado por la cepa M382 (Datos complementarios 1). . Estas cepas se clasificaron además en 16 especies, incluidas Alliroseovarius crassostreae, Leisingera caerulea, Leisingera aquaemixtae, Phaeobacter inhibens, Sulfitobacter mediterraneus, Sulfitobacter pontiacus y 10 especies nuevas (Datos complementarios 1).

Para estudiar las relaciones evolutivas entre las cepas de Roseobacter de biopelícula y las cepas de Roseobacter informadas anteriormente, se descargaron 95 genomas completos del NCBI y se utilizaron como referencias para construir un árbol filogenético con los 54 genomas documentados en este estudio, utilizando 31 genes conservados de copia única. Estos genomas de referencia incluían miembros representativos y bien estudiados del grupo Roseobacter, como Planktomarina temperate RCA23 y R. pomeroyi DSS-3. Se encontró que el patrón del árbol era consistente con los hallazgos de la clasificación taxonómica e indicó que nuestro esfuerzo de aislamiento y secuenciación del genoma había identificado varios linajes nuevos (Fig. 1). Por ejemplo, M382 formó una rama independiente, mientras que M385 y S2214 estaban situadas relativamente lejos de las otras cepas. En particular, no se informaron genomas completos de Leisingera antes del estudio actual (Fig. 1).

Los genes de copia única (n = 31) predichos a partir de estos genomas se concatenaron para construir el árbol. Se utilizó el método de máxima verosimilitud basado en el modelo matricial de Jones-Taylor-Thornton. Los valores de Bootstrap derivados de 500 cálculos replicados se muestran en las ramas de los árboles. Las 54 cepas aisladas del estudio actual están etiquetadas con puntos negros en el contorno. La "S" en los puntos negros indica la presencia del grupo de genes sox.

Como la clasificación GTDB-TK y el análisis filogenético se basan únicamente en genes conservados, se calculó la identidad de nucleótidos promedio (ANI) basada en secuencias de todo el genoma. La comparación por pares de los 54 genomas reveló valores de ANI que oscilaron entre 76,52% y 98,99% (Figura 1 complementaria), lo que indica que representan cepas distintas. Comparación entre M382 y sus cepas de referencia estrechamente relacionadas R. pomeroyi DSS-3, Ruegeria sp. AD91A y Ruegeria sp. THAF33 reveló valores de identidad más bajos (78,6, 78,1 y 78,2, respectivamente) que las identidades entre las tres especies de Ruegeria referenciadas (78,9, 79,4 y 91,0, respectivamente) (Figura complementaria 2), lo que indica que probablemente representa un nuevo género. Juntos, hemos descubierto nuevos miembros de Roseobacter y hemos ampliado la información genómica de este grupo bacteriano.

Con las secuencias completas del genoma en la mano, a continuación analizamos los potenciales genómicos de estas cepas de Roseobacter asociadas a biopelículas. Supusimos que se podrían detectar plásmidos de biopelículas ejemplificados por la presencia de un operón ramnosa31. De hecho, la mayoría de estas bacterias albergaban genes relacionados con la formación de biopelículas en sus plásmidos, aunque no se detectó ningún operón ramnosa (Figura complementaria 3). Se detectaron genes responsables de la biosíntesis del ácido colánico en los plásmidos de 10 cepas de Leisingera (Figura complementaria 3). El gen de la hemaglutinina filamentosa se identificó en los plásmidos de tres cepas de Aliiroseovarius y una cepa de Leisingera (Figura complementaria 3). Se identificaron genes de biosíntesis de succinoglicanos en una cepa de Leisingera y dos cepas de Sulfitobacter (Figura complementaria 3). El gen de producción de exopolisacáridos exoQ se observó en una cepa de Leisingera (Figura complementaria 3). Se ha informado que todos estos genes contribuyen a la formación de biopelículas en una variedad de especies32,33,34. Para proporcionar una vista detallada de los plásmidos de biopelículas, el mapa de un Leisingera sp. El plásmido M527 se dibujó como ejemplo para mostrar la presencia de diversas vías para la biosíntesis y el transporte de polisacáridos en un plásmido (Figura complementaria 4).

Con respecto al metabolismo central del carbono, los componentes del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) estaban completamente representados en todos los genomas. Se identificaron enzimas clave de la vía de Entner-Doudoroff (ED) y de la vía de las pentosas fosfato (PP), como la glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf, K00036) y la glucosa-6-fosfato isomerasa (pgi, K01810). en todos los genomas. Por el contrario, la vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) estaba incompleta en los genomas de todas las cepas de Phaeobacter, Ruegeria y Sulfitobacter, así como en M382, M385 y S2214, con ausencia de las enzimas clave 6-fosfofructoquinasa 1 ( K00850) y 2 (K16370) (Figura complementaria 5). Ningún genoma poseía vías para la fijación de dióxido de carbono, lo que sugiere un estilo de vida heterótrofo. En términos del metabolismo del nitrógeno, en 53 de los 54 genomas (Figura complementaria 6). La presencia de estos genes sugirió un potencial para la respiración utilizando nitrato o nitrito como aceptores de electrones. También analizamos la disponibilidad potencial de oxígeno como aceptor de electrones en la respiración. Todos los genomas poseían diversos genes metabólicos del citocromo, incluidos los que usan el citocromo cbb3 y los que usan el citocromo c como sustratos (Figura complementaria 7). Se sabe que las citocromo cbb3 oxidasas, que tienen una alta afinidad por el oxígeno, son utilizadas a menudo por los microbios aeróbicos, mientras que las citocromo c oxidasas, que tienen una baja afinidad por el oxígeno, se encuentran en los microbios anaeróbicos35. Por lo tanto, la presencia de citocromo cbb3 oxidasas y citocromo c oxidasa implicaba el potencial para la respiración tanto aeróbica como anaeróbica.

El contenido del genoma se analizó más a fondo en términos de metabolismo del azufre. De acuerdo con nuestra hipótesis propuesta en la Introducción, se identificaron diversas vías de oxidación u reducción de azufre. La presencia de los genes sat (K00958) y cys (K00860, K00390, K00380 y K00381) sugirió la capacidad de reducción de sulfatos asimiladores, mientras que la presencia de sulfuro: quinona oxidorreductasas (K17218) sugirió el potencial de oxidación de sulfuros. En términos de oxidación de tiosulfato, 50 de los 54 genomas poseían grupos completos de genes sox, que comprenden soxA (K17222), soxX (K17223), soxB (K17224), soxC (K17225), soxD (K22622), soxY (K17226) y soxZ. (K17227) (Figura complementaria 8). Se dibujaron patrones secuenciales del grupo de genes sox, revelando patrones casi idénticos en todas las cepas excepto Sulfitobacter sp. S223, Yoonia sp. S2214 y Rhodobacteraceae sp. M382 (Figura complementaria 9). Además, se analizó la ruta evolutiva del grupo de genes sox comparando el árbol de genes funcionales basado en genes sox concatenados (n = 7) con el árbol de especies basado en genes concatenados de una sola copia (n = 31), revelando patrones de topología de árbol similares. (Figura complementaria 10).

En conjunto, los análisis genómicos revelaron que (1) la presencia de nuevos plásmidos de biopelículas en cepas marinas de Roseobacter; (2) estas cepas de Roseobacter pueden utilizar varios oxidantes para la respiración; (3) la conservación del grupo de genes sox implica funciones conservadas asociadas con la oxidación de tiosulfato.

La prevalencia de genes sox sugirió que las cepas de Roseobacter de biopelículas son importantes oxidantes de tiosulfato en las biopelículas oceánicas globales, lo que nos motivó a analizar su abundancia en metagenomas de biopelículas recolectados en diferentes provincias y profundidades oceánicas. Con este fin, se obtuvieron 152 microbiotas asociadas a biopelículas (biopelículas y tapetes), incluidas seis biopelículas recién recolectadas en el presente estudio (muestras de biopelículas recolectadas en septiembre de 2020, noviembre de 2020, enero de 2021, marzo de 2021, mayo de 2021 y julio de 2021). que fueron etiquetados como biofilm_1, biofilm_2, biofilm_3, biofilm_4, biofilm_5 y biofilm_6, respectivamente), 101 biofilms recolectados en ocho ubicaciones de la superficie del océano en nuestro estudio anterior18, cuatro tapetes microbianos de los océanos superficiales36, ocho biofilms de superficie plástica37, dos -biopelículas superficiales38, tres biopelículas en las superficies de las raíces de pastos marinos39, dos biopelículas de los campos de respiraderos hidrotermales de la Ciudad Perdida40, cuatro biopelículas de los campos de respiraderos hidrotermales de la Ciudad Vieja41, tres esteras de la piscina hidrotermal del fondo marino de Kallisti Limnes42 y 19 biopelículas de la superficie de las chimeneas de respiraderos hidrotermales de tres provincias oceánicas (Datos complementarios 2). Paralelamente, se analizaron y compararon 187 metagenomas de microbiota de vida libre, incluidas 155 muestras de agua de mar superficial del proyecto Tara Ocean43 y 32 muestras de fluidos de respiraderos hidrotermales (Datos complementarios 2). Los resultados mostraron un amplio enriquecimiento de las cepas de Roseobacter en la microbiota asociada a biopelículas, independientemente de la ubicación, la profundidad, el tipo de sustrato y el momento del desarrollo de la biopelícula (Fig. 2). La cepa más abundante fue Jannaschia sp. W003, que representó el 1,88% de una biopelícula formada sobre una superficie plástica en el Mar de China Oriental (Fig. 2). Las cepas más enriquecidas fueron L. aquaemixtae M602, L. aquaemixtae S166 y Leisingera sp. M523, que mostró patrones de distribución claramente contrastantes entre muestras asociadas a biopelículas y muestras de vida libre (Fig. 2). Las cepas de Phaeobacter solo estaban presentes en varias biopelículas y eran casi indetectables en toda la microbiota de vida libre (Fig. 2). Resumir los porcentajes totales de las 54 cepas en diferentes comunidades sugirió que representaban un total de 0,12 a 6,32 % (en promedio, 1,00 %) en las biopelículas de la superficie del océano, en comparación con sólo 0,03 a 0,38 % (en promedio, 0,08 %) en las biopelículas de la superficie del océano. muestras de agua de mar superficial. Paralelamente, representaron entre el 0,07 y el 3,38 % (en promedio, el 0,48 %) en las biopelículas de los respiraderos hidrotermales, en comparación con solo el 0,05-0,08 % (en promedio, el 0,07 %) en las muestras de fluidos de los respiraderos hidrotermales (Figura complementaria 11).

El patrón de distribución se dibujó mapeando lecturas de 339 (152 metagenomas de biopelículas y tapetes versus 187 metagenomas de agua de mar y fluidos de respiraderos hidrotermales) a cromosomas de las 54 cepas de Roseobacter derivadas de biopelículas usando BBMap (identidad de alineación mínima = 0,80). Todos los metagenomas se normalizaron a 1.000.000 de lecturas con una longitud de lectura de 101 pb. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para estimar la contribución del grupo Roseobacter a la oxidación de tiosulfato en biopelículas marinas, analizamos las afiliaciones taxonómicas de los genes sox en los seis metagenomas de biopelículas secuenciados en el presente estudio. El ensamblaje de los seis metagenomas generó 5.698.001, 5.046.598, 6.876.380, 2.461.921, 5.467.731 y 8.910.019 contigs, respectivamente, y se prevé que representen 3.182.941, 2.784.653, 3.334.736, 1,28. 6.705, 2.810.401 y 6.312.794 ORF cerrados (Datos complementarios 3). La anotación genética y el análisis taxonómico de los ORF soxX y soxA revelaron que un gran porcentaje de estos ORF estaban afiliados a Roseobacter, como Sulfitobacter, Ruegeria, Roseovarius, Octadecabacter, Phaeobacter y Roseibium (Figura complementaria 12). También se realizaron análisis taxonómicos de dos genes relacionados con la respiración anaeróbica, napA y nirK. Si bien solo unos pocos ORF napA pertenecían al grupo Roseobacter, un número sustancial de ORF nirK estaban afiliados a géneros afiliados a Roseobacter, incluidos Sulfitobacter, Phaeobacter, Roseovarius y Roseobacter (Figura complementaria 13).

Para estudiar la actividad in situ de las cepas de biopelículas de Roseobacter, se realizó una secuenciación metatranscriptómica en las seis biopelículas marinas costeras recolectadas en el presente estudio. El ensamblaje de los seis metatranscriptomas generó 2.515.854, 3.111.162, 3.316.686, 3.845.996, 855.508 y 1.124.063 contigs, respectivamente, y se prevé que representen 2.999.230, 3.703.787, 1.242.031, 1,5. 37,969, 402,727 y 1,189,877 ORF cerrados (Datos complementarios 4). Después del mapeo de lectura y la anotación ORF, se compararon los niveles de transcripción (indicados por lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas o RPKM) de todos los genes involucrados en el metabolismo energético y, en todos los casos, todos los genes sox se clasificaron dentro del 50% superior. (Fig. 3a – f para biopelícula_1, _2, _3, _4, _5, _6, respectivamente). Entre los siete genes sox, soxY tendía a ser más activo que los otros genes. Por ejemplo, en la biopelícula recopilada en julio de 2021 (biofilm_6), soxY se ubicó en el 10% superior de todos los genes involucrados en el metabolismo energético (Fig. 3f).

Las biopelículas se recolectaron en septiembre de 2020 (a), noviembre de 2020 (b), enero de 2021 (c), marzo de 2021 (d), mayo de 2021 (e) y julio de 2021 (f). Los genes se predijeron a partir de metatranscriptomas ensamblados y fueron anotados por KEGG. Los análisis de clasificación de los siete genes sox entre todos los genes KEGG del metabolismo energético se basan en sus valores de lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas (RPKM). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para estudiar la proporción de transcripciones activas en las cepas aisladas de Roseobacter de biopelícula, las lecturas metatranscriptómicas se asignaron a los 54 genomas. En total, estos genomas reclutaron 3,19%, 4,00%, 3,79%, 3,80%, 3,85% y 10,35% de lecturas de los seis metatranscriptomas, respectivamente (Figura 14 complementaria), lo que sugiere que estas bacterias están activas en las comunidades de biopelículas. Para estimar aún más la contribución de las cepas de Roseobacter a la oxidación de tiosulfato, se extrajeron los ORF soxA y soxX (ya que estos dos genes tienen funciones clave en la oxidación de tiosulfato) de metatranscriptomas de biopelículas ensamblados y se analizaron sus afiliaciones taxonómicas. A nivel de género, hasta el 21,05% de los genes soxA y hasta el 20,00% de los genes soxX (Fig. 15 complementaria) se asociaron con Sulfitobacter, y estos dos genes también representaron porcentajes relativamente altos en otros géneros afiliados a Roseobacter, como como Roseobacter, Roseovarius y Roseibium. Estos resultados sugirieron que el grupo Roseobacter es el principal contribuyente a la oxidación de tiosulfato en biopelículas marinas. Además, se realizó un análisis taxonómico de napA y nirK. Si bien ninguno de los 20 ORF napA principales pertenecía al grupo Roseobacter, un número sustancial de ORF nirK pertenecían a géneros afiliados a Roseobacter, como Sulfitobacter, Roseovarius, Roseobacter y Phaeobacter (Figura complementaria 16), lo que sugiere que se podría utilizar nitrito. como aceptor de electrones por el grupo Roseobacter en las biopelículas.

Antes de realizar experimentos de oxidación de tiosulfato para cepas representativas de la biopelícula Roseobacter, exploramos sus características fisiológicas generales. Se observaron fenotipos de nueve cepas representativas (nueve cepas que representan los nueve géneros diferentes) mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Todas las cepas observadas mostraron formas de bastones u ovaladas con longitudes de células que oscilaban entre 0,5 y 3,0 μm (Figura complementaria 17). Cuando se cultivaron en el caldo marino medio complejo 2216, todas las cepas pudieron crecer aeróbicamente y anaeróbicamente con una temperatura de crecimiento opcional de 22 a 26 °C, y varias cepas acumularon biomasa comparable cuando se cultivaron en estas dos condiciones (Figura complementaria 18). Por ejemplo, las densidades ópticas máximas a 600 nm (OD600) de P. inhibens M623 alcanzaron 1,28 cuando se cultiva aeróbicamente, mientras que alcanzan 1,20 cuando se cultiva anaeróbicamente (Figura complementaria 18).

La oxidación de tiosulfato se examinó en las nueve cepas representativas tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Estas cepas se cultivaron planctónicamente en medios artificiales de agua de mar (es decir, medios mínimos) con tiosulfato 10 mM. La acumulación de sulfato (>0,1 mM) en los cultivos se observó en las seis cepas (M382, M583, M619, S051, S190 y S2214) que poseen los genes sox mediante precipitación con bario después de eliminar las células bacterianas de los cultivos y producción de sulfato. se detectó (Fig. 19 complementaria). En particular, la tasa de producción de sulfato de Rhodobacteraceae sp. Se muestra M382 (Fig. 4a). Esta cepa fue seleccionada como modelo para los siguientes análisis y experimentos, porque probablemente representa un nuevo género y se puede lograr su manipulación genética. En ambas condiciones, la concentración de sulfato en los cultivos de M382 aumentó junto con el crecimiento bacteriano (Fig. 4a, b). Por el contrario, las concentraciones de sulfato en los cultivos de dos cepas mutantes de M382, M382-ΔsoxX y M382-ΔsoxA mostraron una ligera disminución (Fig. 4a, b), lo que confirma el papel de los genes sox en la oxidación del tiosulfato y la producción de sulfato. La ligera disminución en la concentración de sulfato puede deberse al consumo de asimilación del sulfato originalmente presente en el agua de mar. Para confirmar la producción de sulfato de bario, se examinó el sedimento de una muestra analizada mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Fig. 4c) y se observaron los espectros dominantes de bario, azufre y oxígeno (Fig. 4d). Estos resultados sugirieron que las cepas de biopelícula Roseobacter utilizan genes sox para la oxidación del tiosulfato en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. Estos resultados también mostraron que cuando se cultivaron planctónicamente, la mutación de los genes soxX o soxA no afectó el crecimiento de M382 (Fig. 4a, b), y nos motivó a examinar el crecimiento de M382, M382-ΔsoxX y M382 de tipo salvaje. -ΔsoxA en estado de biopelícula. Después del cultivo en condiciones aeróbicas o anaeróbicas en medios de agua de mar artificiales con tiosulfato 10 mM en biopelículas, la cepa de tipo salvaje mostró una densidad celular significativamente mayor que los dos mutantes (Figura complementaria 20), lo que sugiere que la oxidación del tiosulfato puede afectar el crecimiento bacteriano cuando han formado biopelículas en lugar de crecer planctónicamente.

El M382 de tipo salvaje y sus dos cepas mutantes se cultivaron planctónicamente en un medio mínimo con tiosulfato 10 mM, seguido de la medición de las densidades ópticas de las células a 600 nm (a) y las concentraciones de sulfato en el medio (b) en tres puntos temporales. . Los valores se muestran como media ± sd (n = 3 réplicas biológicamente independientes). c Micrografía electrónica de barrido del sedimento (sulfato de bario) producido al agregar cloruro de bario al cultivo diluido de M382 cultivado con tiosulfato. d Espectros elementales del pellet. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, investigamos la estrategia del metabolismo del tiosulfato en la biopelícula M382 mediante transcriptómica. Se estudiaron los perfiles de transcripción genética de biopelículas M382 cultivadas en medios complejos con o sin tiosulfato (los datos se muestran en los Datos complementarios 5). En total, 68 genes KEGG (genes que podrían ser anotados por KEGG) fueron significativamente (cambio >2 y valor de P <0,05 según la prueba t de Student) regulados positivamente por el tiosulfato, 58 genes KEGG fueron regulados negativamente, mientras que 4607 genes KEGG los genes permanecieron sin cambios (Figura complementaria 21). En particular, la transcripción de todos los genes sox fue inducida por tiosulfato (Fig. 5a). Por ejemplo, hubo una inducción de más de 14 veces de la transcripción soxC (Fig. 5a). Además, el tiosulfato también indujo varios genes relacionados con la respiración anaeróbica, incluido el gen que codifica la proteína de tipo ferredoxina napH (K02574), la D-lactato deshidrogenasa dld (K03777), el gen biogenético del citocromo c ccdA (K06196) y el dimetilo anaeróbico. sulfóxido reductasa dmsC (K07308) (Fig. 5b). Además, dos ORF que codifican PorD (K11069), la proteína de unión al sustrato del sistema de transporte de espermidina/putrescina, fueron regulados positivamente por tiosulfato, así como un ORF que codifica la proteína de membrana externa OmpW (K07275) (Fig. 5c). , que se ha informado que desempeña un papel en la formación de biopelículas44,45. Como ejemplo, PotD es una proteína periplásmica que se une a espermidina/putrescina, y su sobreexpresión promueve fuertemente la formación de biopelículas en Escherichia coli44, y la cepa mutante ΔompW de Acinetobacter baumannii mostró una formación de biopelículas reducida45. La lista completa de genes con niveles de transcripción significativamente más altos en el cultivo de tiosulfato se muestra en la Figura complementaria 22, mientras que los genes regulados negativamente se muestran en la Figura complementaria 23. Vale la pena mencionar que la transcripción del gen sat (K00958) y tres genes cys (K00381 y dos genes K00390) fueron regulados negativamente por el tiosulfato (Figura complementaria 23), lo que sugiere el efecto inhibidor del tiosulfato sobre la reducción del sulfato.

Se muestran genes o proteínas asociados con la oxidación de tiosulfato (a transcriptómica; b proteómica de membrana), la respiración anaeróbica (c transcriptómica; d proteómica de membrana) y la formación de biopelículas (e transcriptómica; f proteómica de membrana). Nombres completos de los genes en los resultados de la transcriptómica: napH, proteína tipo ferredoxina; ldh, lactato deshidrogenasa; ccdA, proteína de biogénesis de tipo citocromo c; dmsC, subunidad C de dimetilsulfóxido reductasa anaeróbica; potD, proteína de unión al sustrato del sistema de transporte de espermidina/putrescina; ompW, una proteína de la membrana externa. Nombres completos de las proteínas en los resultados de la proteómica: CcdA, proteína de biogénesis del citocromo c; Ldh, lactato deshidrogenasa; FdoG, subunidad mayor de formiato deshidrogenasa; FdoH, subunidad hierro-azufre de formiato deshidrogenasa; CCP, citocromo c peroxidasa; CcmF, proteína de biogénesis de tipo citocromo c; NorD, óxido nítrico reductasa. Wza o GfcE, proteína de biosíntesis/exportación de polisacáridos; GspDEKLM, proteínas de la vía de secreción general; KpsC, proteína exportadora de polisacáridos capsulares; KpsT, proteína de unión a ATP del sistema de transporte de polisacáridos capsulares. En los gráficos de barras, los valores se muestran como media ± sd (n = 3 réplicas biológicamente independientes para transcriptómica y n = 4 réplicas biológicamente independientes para proteómica). Las estadísticas en ambos análisis se realizaron utilizando la prueba t de Student bilateral con umbrales de cambio >2 y valor de P <0,05 (*valor de P <0,05; **valor de P <0,01; ***valor de P <0,001). Valores exactos de P en a: 0,0002, 0,0005, 1,7E-05, 0,0136, 0,0031, 0,0013, 0,0225; b: 0,0011, 0,0032, 7,5E-07, 1,5E-06, 7,8E-08, 3,8E-06, 0,0001; c: 0,0067, 0,0032, 0,0039, 0,0251; d: 4.5E-05, 0,0014, 0,0173, 0,0015, 0,0006, 0,0008, 0,0183, 0,0120; mi: 0,0469, 0,0353, 0,0255; f: 0,0006, 0,0001, 0,0013, 0,0002, 0,0053, 0,0075, 0,0004, 0,0048, 0,0023, 0,0112. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Debido a que era probable que muchos de los genes inducidos por tiosulfato en la biopelícula M382 codificaran proteínas (por ejemplo, OmpW como se mencionó anteriormente) que están localizadas en la membrana celular, utilizamos la proteómica para explorar el reordenamiento de las proteínas de la membrana causado por el cultivo con tiosulfato, y Los resultados finales respaldaron nuestras expectativas. Hasta 304 proteínas mostraron un aumento significativo (prueba t de Student, valor de P <0,05) en la membrana celular después del tratamiento con tiosulfato, mientras que la abundancia de 149 proteínas disminuyó (Figura complementaria 24 y Datos complementarios 6). Es digno de mención que las siete proteínas SOX mostraron cambios de 2,40 a 64,93 veces en el proteoma de la membrana después de la adición de tiosulfato (Fig. 5d y Datos complementarios 6), lo que sugiere su localización en la membrana celular durante la oxidación del tiosulfato. Además, de acuerdo con los datos transcriptómicos, el tiosulfato elevó los niveles de varias proteínas involucradas en la respiración anaeróbica (Fig. 5e y Datos complementarios 6) en la membrana celular. Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa es una enzima importante en la vía metabólica anaeróbica donde cataliza la conversión reversible de lactato en piruvato46, y se ha observado que la citocromo c peroxidasa (CCP) degrada el peróxido de hidrógeno en E. coli anóxica, y la transcripción de ccp requiere la ausencia de oxígeno47. Además, las proteínas responsables de la formación de biopelículas mostraron una mayor abundancia en las biopelículas tratadas con tiosulfato (Fig. 5f y Datos complementarios 6). Por ejemplo, en las bacterias Gram negativas, la vía secretora general incluye el sistema de secreción tipo II y el pilus tipo IV48, los cuales desempeñan funciones importantes en la formación de biopelículas en una variedad de especies49,50. Basándonos en la mayor abundancia de proteínas involucradas en la respiración anaeróbica y la formación de biopelículas, especulamos que el tiosulfato se utiliza como fuente de energía en el estado de biopelícula. Para probar esta especulación, medimos las fuerzas motrices de protones (PMF) en las biopelículas de M382 con o sin tiosulfato. Esto demostró que la adición de tiosulfato aumentó la producción de PMF (Figura complementaria 25). Finalmente, se proporciona un modelo esquemático que muestra la promoción de la respiración anaeróbica y la formación de biopelículas mediante la oxidación de tiosulfato (Fig. 6).

El modelo se basa principalmente en los resultados de la proteómica de la membrana celular y se resumen las funciones de las proteínas con mayor abundancia.

Aunque la mayoría de los miembros conocidos de este clado son cultivables, las cepas de Roseobacter son importantes y requieren una investigación más profunda debido a la diversidad de sus hábitats y actividades metabólicas51. Aquí, realizamos una investigación exhaustiva de las cepas de Roseobacter de biopelículas, centrándonos específicamente en su papel en la oxidación del tiosulfato. Los resultados de la genómica funcional, la metagenómica global y la metatranscriptómica mejoran la visión ecológica del grupo marino Roseobacter desde tres perspectivas principales.

Primero, el descubrimiento de nuevos plásmidos de biopelículas en cepas de Roseobacter. Existe evidencia experimental de que la biopelícula es un punto caliente de intercambio de genes mediado por la transferencia de elementos móviles, incluidos los plásmidos52, pero la función y la diversidad de los plásmidos en las cepas marinas de Roseobacter siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, encontramos que, de acuerdo con un plásmido previamente informado que codifica un operón ramnosa en Phaeobacter inhibens DSM 1739531, las cepas de biopelícula Roseobacter contienen una variedad de plásmidos que codifican genes para la biosíntesis de sacáridos, incluidos succinoglicano, polisacárido capsular, adhesina y manosa, que facilitan la adhesión durante la formación de biopelículas. Teniendo en cuenta que el número de copias de genes relacionados con biopelículas en los plásmidos es probablemente mayor que el de los cromosomas, nuestros resultados resaltan el importante papel de los plásmidos en la transmisión de rasgos específicos de nicho, y que los plásmidos de biopelículas son más diversos de lo que se esperaba anteriormente. Además, la presencia de genes de respiración de nitrógeno en plásmidos de biopelículas de cepas de Roseobacter sugiere su papel en la facilitación de la transferencia de electrones, lo que podría ser importante para la oxidación del tiosulfato.

En segundo lugar, la división de nichos de las cepas marinas de Roseobacter se observa constantemente desde las aguas superficiales hasta las profundidades del océano. Estudios anteriores han informado que la distribución de Roseobacter estaba asociada con una floración de cocolitóforos en el noroeste del Mar Negro y dependía en gran medida de las especies de fitoplancton productoras de dimetilsulfoniopropionato53,54. Aquí, proporcionamos una imagen completa de la distribución selectiva de las cepas de Roseobacter entre la biopelícula y el agua, lo que sugiere que la formación de biopelículas contribuye significativamente a la distribución de Roseobacter en el océano global. Teniendo en cuenta que la biopelícula y los metagenomas del agua de mar se recolectaron en diferentes estaciones, el enriquecimiento de estas cepas de Roseobacter en biopelículas marinas no se ve afectado en gran medida por las condiciones de floración. En cambio, la preferencia por el nicho de la biopelícula puede estar impulsada por la estratificación redox, dado que estas cepas de Roseobacter son capaces de crecer tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas.

En tercer lugar, es probable que las cepas de Roseobacter sean uno de los principales consumidores de tiosulfato en los ambientes de respiraderos hidrotermales. En un estudio anterior14, se aislaron cepas de Roseobacter de ambientes de respiraderos hidrotermales, como TB66, aislado de una muestra de respiradero de Galápagos. Roseovarius tolerans está estrechamente asociado con TB66 y muestra actividad oxidante de tiosulfato14. Muchas de las cepas de Roseobacter reportadas en campos de respiraderos habitan en tapetes de biopelículas y se supone que una cepa de Sulfitobacter puede fijar dióxido de carbono mientras usa compuestos reducidos de azufre para su crecimiento55. Por lo tanto, las cepas de Roseobacter, particularmente aquellas que habitan en biopelículas, pueden haber sido ignoradas durante la elaboración de perfiles del ciclo del azufre en ecosistemas de respiraderos hidrotermales en estudios previos que han descrito a Campylobacterota (anteriormente denominada Epsilonproteobacteria) como los principales actores involucrados en la oxidación de tiosulfato36,56.

La presencia de oxidación de tiosulfato ha sido ampliamente documentada en simbiontes de animales de aguas profundas57,58. Sin embargo, debido a la falta de evidencia experimental, los mecanismos precisos de oxidación del tiosulfato en estos simbiontes no están claros. Sin embargo, se puede especular que, en estas bacterias, la oxidación del tiosulfato puede ocurrir de forma anaeróbica, ya que el oxígeno es escaso en muchos ambientes de aguas profundas y su concentración en los tejidos animales es probablemente mucho menor que en el agua de mar circundante. De manera similar, los microambientes en la base de las biopelículas son en gran medida anaeróbicos debido a la acumulación de sustancias poliméricas que impiden la penetración de oxígeno59,60,61. Aquí, hemos proporcionado evidencia consistente de que un gran porcentaje de genes sox expresados ​​en biopelículas están asociados con el grupo Roseobacter, y la activación de genes involucrados en la respiración anaeróbica sugiere que la oxidación de tiosulfato es principalmente anaeróbica. La activación de genes nirK afiliados a Roseobacter en metagenomas de biopelículas sugirió la utilización de nitrito como aceptor final de electrones. Por lo tanto, aunque no hay datos para cuantificar la contribución de los microbios simbiontes y asociados a biopelículas en la oxidación del tiosulfato marino, se puede concluir que una gran proporción del tiosulfato en ambientes marinos probablemente se oxida anaeróbicamente.

A pesar de numerosos estudios que han investigado el proceso de desarrollo de biopelículas, la energía que promueve la formación de biopelículas en ambientes marinos no se conoce bien. Se sugiere que la formación de biopelículas requiere energía además de la que sustenta la vida básica de los microbios62. Aquí, proporcionamos evidencia proteómica de que el tiosulfato puede cambiar la composición proteica de la membrana celular de una cepa de Roseobacter para mejorar la formación de biopelículas y la respiración anaeróbica. Consistentemente, la mutación de los genes sox reduce la densidad celular en las biopelículas y la adición de tiosulfato promueve la producción de PMF, lo que sugiere que es probable que la oxidación del tiosulfato contribuya a la producción de energía. Además, en otros entornos, se sabe que la oxidación del tiosulfato está acoplada a varias actividades fisiológicas importantes (p. ej., en simbiontes, se cree que la oxidación del tiosulfato es una fuente de energía esencial para la fijación de carbono57,58). Por lo tanto, proponemos que es probable que el tiosulfato proporcione energía para la formación de biopelículas. Sin embargo, esta noción debe demostrarse más en futuros estudios.

Para responder a las dos preguntas clave planteadas al comienzo de este artículo, hemos demostrado que (1) las cepas de Roseobacter son los principales actores en la oxidación del tiosulfato en las biopelículas marinas, y (2) el tiosulfato en las biopelículas marinas se oxida en gran medida de forma anaeróbica y es de gran importancia para las bacterias asociadas a la superficie. Existen limitaciones para el estudio actual. Por ejemplo, aquí nos hemos centrado en cepas cultivables de Roseobacter en biopelículas marinas, mientras que no se utilizaron genomas ensamblados en metagenomas. Esto se debe en gran medida a la alta diversidad microbiana de las biopelículas marinas, lo que dificulta la recuperación de genomas de alta calidad a partir de metagenomas de biopelículas. Además, aquí nos centramos en los análisis del sistema sox en la oxidación de tiosulfato, que podría estar mediada por otros genes (por ejemplo, la tiosulfato deshidrogenasa tsdA que trabaja junto con soxB63). Sin embargo, nuestros resultados revelaron la identidad y las propiedades funcionales de las cepas de Roseobacter asociadas a la superficie que pueden contribuir a la función clave de la oxidación del tiosulfato en los ecosistemas marinos. Teniendo en cuenta la complejidad del ciclo natural del azufre, el papel previamente descuidado de las bacterias asociadas a la superficie en el ciclo del azufre marino requiere una mayor aclaración.

En marzo de 2019 se recolectaron biopelículas para aislamiento bacteriano en la zona costera de Qingdao, China (36,05, 120,43). Las biopelículas naturales en las superficies rocosas a una profundidad de 1 a 2 m en la zona submareal se rasparon con puntas de algodón esterilizadas y se transfirieron inmediatamente al laboratorio. Las puntas de algodón se enjuagaron minuciosamente con 10 ml de agua de mar filtrada a 0,1 μm y esterilizada en autoclave antes de diluirlas 10 y 100 veces. Para cada biopelícula, se esparcieron alícuotas de 100 µl en placas de agar marino 2216 (BD, Difco). Las incubaciones microbianas posteriores se realizaron en condiciones aeróbicas a 25 °C con radiación solar artificial. Las colonias se examinaron bajo un microscopio de disección en busca de características morfológicas que incluyen tamaño, color, forma y topografía de la superficie. Se aislaron tipos de colonias visibles y se extrajo el ADN de las células calentando a 100 °C durante 5 minutos. Se realizó una PCR para amplificar los genes de ARNr 16S utilizando los cebadores universales 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') y 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), seguido de secuenciación de Sanger (para cada cepa, se realizaron reacciones directas e inversas). realizado para obtener la secuencia completa del gen 16S rRNA) en el Instituto de Genómica de Beijing (BGI, China) para identificar la taxonomía de los aislados.

Antes de la secuenciación del genoma, el ADN de las cepas bacterianas cultivadas se extrajo utilizando el kit TIANamp Genomic DNA (Tiangen Biotech, China), siguiendo el protocolo del fabricante con modificaciones. Se añadió lisozima hasta una concentración final de 10 mg/ml y se incubó a 37 °C durante 30 min. El tampón de lisis (tampón GA) y los tampones GB, GD y GW se agregaron según lo especificado en el protocolo del fabricante. La integridad del ADN se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa en un sistema Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, EE. UU.). La secuenciación de PacBio e Illumina se realizó en el Instituto de Bioinformática Novogene (Novogene, China). Para cada cepa bacteriana, se realizó la secuenciación monomolecular en tiempo real (SMRT) de PacBio utilizando la estrategia de secuenciación circular de consenso (CCS) para generar 1 Gb de datos (longitud de lectura N50 >9000 pb), y la secuenciación de Illumina se realizó en NovaSeq. Sistema 6000 para generar 2 Gb de datos (longitud de lectura = 150 pb). El ensamblaje y la corrección preliminares se realizaron con SMRT Link v5.0.1 (CCS = 3, precisión mínima> 0,99) y luego se corrigieron con los datos de Illumina utilizando Minimap2 (Minimap2: alineación por pares para secuencias de nucleótidos). En detalle, los contigs derivados de PacBio se mapearon con las lecturas de Illumina y las ubicaciones sin alineación se corrigieron de acuerdo con los contigs ensamblados a partir de las lecturas de Illumina. Las secuencias de cromosomas y plásmidos se distinguieron en función de la cobertura de lecturas y se examinaron mediante BLASTn para formar un genoma completo. La anotación del genoma se realizó en una plataforma Linux local. Los genes de ARN ribosómico (ARNr) y genes de ARN de transferencia (ARNt) se predijeron utilizando el software Barrnap (//github.com/tseemann/barrnap) y Aragorn64, respectivamente. Los ORF se predijeron utilizando Prodigal (versión 2.60)65 en un modelo de análisis de genoma único con predicción de ORF de extremo cercano. Para el análisis filogenético, 31 genes marcadores esenciales (dnaG, frr, infC, nusA, pgk, pyrG, rplA, rplB, rplC, rplD, rplE, rplF, rplK, rplL, rplM, rplN, rplP, rplS, rplT, rpmA, rpoB , rpsB, rpsC, rpsE, rpsI, rpsJ, rpsK, rpsM, rpsS, smpB y tsf) se extrajeron de los genomas utilizando AMPHORA266. Las secuencias de proteínas de estos genes marcadores se alinearon utilizando MEGA (versión 6.05)67 para construir un árbol de máxima verosimilitud bajo el modo Jones-Taylor-Thornton. Los genes marcadores se alinearon individualmente y luego se concatenaron para generar alineamientos para la construcción de árboles. El árbol se construyó en MEGA67 y los valores de arranque se calcularon con 500 réplicas. El ANI se calculó utilizando el software fastANI68 instalado en un sistema Linux local. Dos especies diferentes muestran <95% ANI69 y dos cepas diferentes tienen <99% ANI70. Para la anotación de genes funcionales, se buscaron las secuencias de proteínas de un genoma determinado con BLASTp (valor E <1e-7) en la base de datos KEGG (versión 2022). Las vías metabólicas se reconstruyeron utilizando el servidor en línea KEGG Mapper (//www.genome.jp/kegg/mapper.html).

En el presente estudio se recolectaron seis nuevas biopelículas, seguidas de una secuenciación metagenómica y metatranscriptómica. Estas biopelículas se rasparon de superficies de piedra submareales en el área costera (36.05, 120.43) de Qingdao, China, en seis momentos (septiembre de 2020, noviembre de 2020, enero de 2021, marzo de 2021, mayo de 2021 y julio de 2021). La extracción de ADN se realizó con el kit de ADN genómico TIANamp (Tiangen Biotech, China) y los pasos detallados son los mismos que los descritos en la sección "Secuenciación y análisis del genoma". La secuenciación metagenómica se realizó en el sistema NovaSeq 6000 en el Instituto de Bioinformática Novogene (Beijing, China). Se generaron lecturas de extremos emparejados con una longitud de lectura de 150 pb después de la construcción de bibliotecas con una inserción de 350 pb. El análisis metagenómico se realizó siguiendo los procedimientos utilizados en nuestros estudios anteriores18,71. En detalle, el control de calidad de las secuencias de Illumina se realizó en nuestro servidor local utilizando el software NGS QC Toolkit (versión 2.0)72. Se eliminaron las lecturas que contenían adaptadores, lecturas de baja calidad (puntuación de calidad <20) o lecturas no emparejadas de alta calidad. Los metagenomas publicados en estudios anteriores18,36,37,38,39,40,41,42,43 también se descargaron de la base de datos NCBI SRA utilizando el script fastq-dump en un sistema Linux. Para calcular la abundancia relativa de las cepas aisladas en metagenomas de vida libre y asociados a biopelículas, todos los metagenomas incluidos para los análisis se normalizaron a 1.000.000 de lecturas y todas las lecturas se recortaron a 101 pb. Las lecturas del metagenoma se asignaron a genomas bacterianos utilizando BBMap73 (identidad de alineación mínima = 0,80). La abundancia relativa se calculó contando el número de lecturas mapeadas. Para determinar la afiliación taxonómica de un gen determinado en los seis metagenomas de biopelículas secuenciados en el presente estudio, las lecturas metagenómicas limpias se ensamblaron usando MEGAHIT74, seguidas de la predicción de ORF usando Prodigal en modo Meta, devolviendo solo ORF cerrados. Los ORF fueron anotados mediante DIAMOND75 BLASTp (valor E <1e-7) buscando en la base de datos KEGG (versión 2022). La afiliación taxonómica a nivel de género se perfiló utilizando la versión Linux 2022 de Kaiju76, con kaiju_db (versión 2022) como referencia.

Las seis muestras de biopelículas (lugares de muestreo y tiempos de recolección descritos anteriormente) se transfirieron inmediatamente al laboratorio, se congelaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La extracción de ARN se realizó mediante un método de lisis TRIzol y se construyeron bibliotecas específicas de Ribo-Zero Strand utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext Ultra (NEB, EE. UU.). Siguiendo las recomendaciones del fabricante, los oligonucleótidos marcados con biotina complementarios al ARNr u otros ARN no codificantes se mezclaron con el ARN total, y el ARNm se retuvo selectivamente y se convirtió en ADNc para la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas (longitud del inserto = 350 pb) se secuenciaron en el sistema Novaseq 6000 en el Instituto de Bioinformática Novogene (Beijing, China) para generar 60 Gb de datos (lecturas de extremos emparejados con una longitud de 150 pb) para cada biopelícula. Se obtuvieron lecturas limpias utilizando el NGS QC Toolkit (versión 2.0)72. Para determinar el porcentaje de las cepas de Roseobacter, las lecturas metatranscriptómicas se asignaron a los 54 genomas utilizando BBMap73 (identidad de alineación mínima = 0,80) y la abundancia relativa se calculó contando el número de lecturas asignadas. Para determinar el nivel de expresión y la afiliación taxonómica de un gen determinado en los metatranscriptomas, las lecturas metatranscriptómicas se ensamblaron utilizando MEGAHIT74. Los ORF se predijeron a partir de los contigs ensamblados utilizando Prodigal en modo Meta, y solo se devolvieron los ORF cerrados para su posterior análisis. Los ORF fueron anotados mediante DIAMOND75 BLASTp (valor E <1e-7) buscando en la base de datos KEGG (versión 2022). Las lecturas metatranscriptómicas limpias se asignaron a secuencias ORF utilizando Bowtie2 v2.4.277. La cobertura de un gen determinado (p. ej., soxA) se calculó utilizando SAMtools v1.1178 para determinar el perfil de expresión génica, mostrado en RPKM. La afiliación taxonómica a nivel de familia y género se perfiló utilizando Kaiju76, con kaiju_db (versión 2022) como referencia.

La eliminación del gen en marco se realizó basándose en la recombinación homóloga utilizando el plásmido pHG1.0 alojado en E. coli DB3.1. Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar dos regiones que flanquean las regiones ascendentes y descendentes del gen diana. En este estudio, se eliminaron dos genes utilizando los cebadores para soxX Up-F (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGATTTCACTGATGGCGGG), soxX Up-R (AAGTGC-GCCTAATCGCGTAGGCGGCCAATGTCAGAGATGT), soxX Down-F (CTACGCGATTAGGCGCACTTTG-ACCGCTCAGGAAATCGAAG), soxX Down-R (GGGGACCACTTTGTACAAGAA AGCTGGGTCATGTC-GAGAACCGACTGGC) , y para soxA Up-F (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCTTTGTC-CCGCCTTCGC), soxA Up-R (AATGCGCCTAATCGCGTAGAGATCGGCGCTTTCGTCG), soxA Down-F (CTACGCGATTAGGCGCACTTTGTATGTTGCATCCCGTGGC) y soxA Down-R (GGGGACCACTTT-GTACAAGAAAGCTGGGTTTGAAAAGCTCG) GCGGGTTC). Las dos regiones flanqueantes se fusionaron mediante una región conectora complementaria que se añadió al extremo 5' de los cebadores Up-R y Down-F. Los cebadores Up-F y Down-R también contenían secuencias de recombinación para la ligación con el plásmido pHG1.0. Luego, utilizando los cebadores Up-F y Down-R y un kit de ADN polimerasa Hi-Fi Taq (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), se generó mediante PCR una "copia mutada" del gen diana. Después de verificar las concentraciones relativas de los productos de la PCR y el plásmido pHG1.0 extraído usando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.), el producto de la PCR se insertó en pHG1.0 usando la mezcla de enzimas Gateway BP clonasa II (Thermo Fisher ). La recombinación se realizó durante dos horas a 25 °C, según las instrucciones del fabricante. Luego, el producto de ADN ligado se transformó en células competentes de E. coli wm3064 utilizando el método de choque térmico (42 °C durante 30 s) y se sembró en placas en agar LB con 50 µg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de 2,6-Diaminopimélico. ácido (DAP) y se incubaron durante 16 h a 37 °C. Las células transformadas con éxito se seleccionaron mediante PCR. Luego, se realizó la conjugación de ADN entre E. coli wm3064 que porta el fragmento de ADN "copia mutada" en pHG1.0 y la cepa M382 usando los siguientes pasos: (1) wm3064 y M382 se cultivaron en medio LB con 50 µg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de DAP y caldo marino 2216, respectivamente, hasta un valor de DO550 de aproximadamente 0,4 a 37 °C y 25 °C, respectivamente; (2) Las células del donante (2 ml de wm3064) y las células receptoras (1 ml de M382) se mezclaron y precipitaron mediante centrifugación a 1792 × g antes de la resuspensión en 200 µl de caldo marino 2216 y se sembraron en caldo marino 2216 con 50 µg. /ml de gentamicina. Como wm3064 no puede crecer sin DAP, este paso permite la selección de M382 con los fragmentos de ADN de la "copia mutada"; (3) Después de una incubación durante la noche a 25 °C, se seleccionaron aproximadamente 500 colonias y se examinaron mediante PCR para determinar una recombinación exitosa; (4) Luego, las células candidatas se transfirieron a medio caldo marino 2216 con 20% de sacarosa para obtener colonias con recombinación en dos pasos.

Durante el experimento de crecimiento bacteriano, las bacterias se cultivaron en medio caldo marino 2216 (BD, Difco) a 25 °C. Para el crecimiento aeróbico, las cepas se cultivaron en aire, mientras que para el crecimiento anaeróbico, las cepas se cultivaron en una mezcla de gas hidrógeno, dióxido de carbono y gas nitrógeno (5/5/95%). La biomasa máxima se registró cultivando las cepas bacterianas durante más de siete días y midiendo los valores de DO600 cada 24 h. Los experimentos de crecimiento se repitieron tres veces en tres ocasiones diferentes. Los fenotipos de las cepas cultivadas se observaron utilizando un sistema TEM JEM-1200EX (JEOL, Japón).

Durante el experimento de oxidación de tiosulfato, las bacterias se cultivaron planctónicamente en medios artificiales de agua de mar que contenían 5% de sales marinas, tiosulfato 10 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM (pH 8,0), 200 µM de hidrogenofosfato de sodio, 500 µM de cloruro férrico. , y 10 mM de cloruro de amonio. Las condiciones aeróbicas y anaeróbicas se establecieron como se describe anteriormente. Las concentraciones de sulfato en los medios se midieron utilizando un kit de ensayo de sulfato (BioVision Inc Milpitas, CA, EE. UU.). Específicamente, las células cultivadas durante 72 h se centrifugaron a 18.928 x g durante 10 minutos y se transfirieron 20 µl del sobrenadante a 190 µl de la solución de tratamiento proporcionada por el kit. Luego se añadieron 100 µl del tampón de detección y se dejó reaccionar durante 15 min a temperatura ambiente. Los estándares se prepararon añadiendo 0, 50, 100 y 200 µl de la solución estándar a 100 µl del tampón de detección. Se agregaron diferentes volúmenes de la solución de tratamiento a los estándares para obtener volúmenes iguales. Los valores de DO se midieron a 600 nm y las concentraciones de sulfato en las muestras se determinaron usando la fórmula sulfato (mM) = muestra DO600/pendiente de concentración estándar × 10. Los gránulos de sulfato de bario se confirmaron usando un sistema SEM TESCAN VEGA3 (TESCAN, Checoslovaquia) . Para el M382 de tipo salvaje y sus dos mutantes, se midieron las acumulaciones de tiosulfato después de cultivos planctónicos de 24, 48 y 72 h. Además, para estudiar la influencia de la mutación del gen sox en el crecimiento de M382 en el estado de biopelícula, se cultivaron biopelículas de la cepa de tipo salvaje y los dos mutantes en el fondo de placas de seis pocillos en medio de agua de mar artificial con tiosulfato 10 mM. Después de 72 horas, las células bacterianas se dispersaron mediante "soplado y succión" usando una pipeta de 1 ml, se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de medio antes de medirlas a OD600.

Las cepas M382 se cultivaron en cultivos por triplicado en caldo marino 2216 con o sin tiosulfato 10 mM y se incubaron en placas de seis pocillos a 25 °C durante 48 h. Después de eliminar el líquido con las bacterias suspendidas, las biopelículas formadas en el fondo de los pocillos se lavaron con medio nuevo antes de transferirlas a los tubos Falcon. Las células se recogieron a 5000 xg durante cinco minutos y se transfirieron inmediatamente a nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo utilizando el kit RNAprep Pure Cell/Bacteria (Tiangen Biotech, Beijing, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas de RNA-seq se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra, siguiendo el protocolo del fabricante, antes de la secuenciación en el sistema Novaseq 6000 en el Instituto de Bioinformática Novogene (Beijing, China) para generar lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Se utilizó NGS QC Toolkit v2.3.3 para filtrar lecturas de baja calidad de los datos sin procesar. Para el cálculo de RPKM, se construyó el índice ORF M382 y las lecturas limpias se asignaron a los ORF utilizando Bowtie 2 v2.4.277. Para estandarizar la expresión genética, el número de lecturas asignadas a cada ORF se convirtió a RPKM utilizando Samtools v1.1178. El valor AP fue <0,05 (prueba t de Student bilateral después de una prueba de normalidad) y se utilizó un valor absoluto de log2 (cambio de RPKM)> 1 como umbrales de significación. Los genes expresados ​​diferencialmente se ilustraron utilizando gráficos de volcanes dibujados en MS Excel y mapas de calor dibujados con Cluster 3.0 (agrupación jerárquica con vinculación promedio79) y Java TreeView80.

Las biopelículas M382 utilizadas para la proteómica de membrana se cultivaron en las mismas condiciones que las utilizadas para la transcriptómica, como se describió anteriormente, excepto que se prepararon cuatro réplicas. Las células se recolectaron a 5000 × g durante 5 minutos y se sometieron a extracción de proteínas de membrana utilizando el kit de extracción de proteínas de membrana bacteriana HR0091 (Biomart, China). Las concentraciones de proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Bio-Rad, EE. UU.). Las proteínas se digirieron con tripsina y los péptidos resultantes se desalinizaron en cartuchos C18 (Empore™ SPE Cartuchos C18, Sigma). Los péptidos desalados se concentraron mediante centrifugación al vacío y se disolvieron en 40 µl de ácido fórmico al 0,1% (v/v). Luego, se realizó LC-MS/MS y la identificación de proteínas en APTBIO (China). Brevemente, el análisis LC-MS/MS se realizó en un espectrómetro de masas timsTOF Pro (Bruker, Millerica, MA, EE. UU.), junto con un Nanoelute (Bruker Daltonics). Los péptidos se cargaron en una columna trampa de fase inversa (Thermo Scientific Acclaim PepMap100, nanoViper C18) en tampón A (0,1 % de ácido fórmico) y se separaron con tampón B (84 % de acetonitrilo y 0,1 % de ácido fórmico) a un caudal de 300 NL/min. Los espectros de MS de movilidad iónica se recogieron en un rango de masa de m/z 100–1700, y se realizaron 10 ciclos PASEF MS/MS con una intensidad objetivo de 1,5 k y un umbral de 2500. Para la identificación y cuantificación de proteínas, se buscaron datos sin procesar de MS utilizando el software MaxQuant v1.5.3.1781. El descubrimiento de proteínas se estableció como una tasa de descubrimiento falso <0,01 y la abundancia de proteínas se determinó utilizando el algoritmo LFQ. El análisis estadístico de las variaciones de la abundancia de proteínas se basó en la prueba t de Student bilateral después de una prueba de normalidad, con umbrales de significación de cambio >2 y valor de P <0,05.

Las biopelículas de M382 utilizadas para las mediciones de PMF se prepararon en las mismas condiciones que las utilizadas para la transcriptómica y la proteómica de membrana. Las células bacterianas se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (pH = 7,4) y se resuspendieron hasta una DO600 de 0,5. Luego se midió PMF utilizando una sonda sensible al potencial de membrana DiSC3(5)82. Se agregaron DiSC3 (5) y KCl a la solución celular hasta concentraciones finales de 1 μm y 100 mM, respectivamente. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y la fluorescencia se registró utilizando un lector de imágenes Biotek Cytation5 (longitud de onda de excitación = 622 ± 10 nm y longitud de onda de emisión = 670 ± 10 nm).

En todos los experimentos, se utilizaron pruebas t de Student bilaterales para detectar diferencias significativas entre el grupo de control y el experimental. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces, cada vez con tres o cuatro réplicas biológicamente independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las secuencias completas del genoma (54 cepas), las lecturas metagenómicas (6 muestras), las lecturas metatranscriptómicas (6 muestras) y los conjuntos de datos transcriptómicos (6 muestras) generados en este estudio se han depositado en la base de datos NCBI-SRA con el código de acceso PRJNA753157. Los datos de proteómica (8 muestras) se han depositado en la base de datos PRIDE con el código de acceso PXD040961. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo está parcialmente financiado por subvenciones de las siguientes organizaciones/programas: (1) Ocean University of China (842041010); (2) Rama de Hong Kong del Laboratorio de Ingeniería y Ciencias Marinas del Sur de Guangdong (SMSEGL20SC02); (3) Departamento de Organización Central (862105020028); y (4) Programa General de Investigación Básica de Shenzhen (JCYJ20210324122211031).

Facultad de Ciencias de la Vida Marina y Laboratorio Clave de Genética y Mejoramiento Marinos del Ministerio de Educación, Universidad Oceánica de China, Qingdao, China

Wei Ding, Shougang Wang, Yi Shu y Yongming Wang

Departamento de Química e Instituto Swire de Ciencias Marinas, Universidad de Hong Kong, Hong Kong, China

Wei Ding, Peiyan Cai y Yong-Xin Li

Instituto de Evolución y Biodiversidad Marina, Universidad Oceánica de China, Qingdao, China

Peng Qin, Shen Fan, Jie Lu, Han Cui y Weipeng Zhang

Centro Científico Frontiers para Multiesferas de los Océanos Profundos y Sistema Terrestre, Universidad Oceánica de China, Qingdao, China

Xiaoyan Su, Meng Wang, Hui-Hui Fu y Yu-Zhong Zhang

Laboratorio Estatal Clave de Tecnología Microbiana, Universidad de Shandong, Qingdao, China

Yu-Zhong Zhang

Laboratorio de Ingeniería y Ciencias Marinas del Sur de Guangdong, Guangzhou, China

Yong-Xin Li

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WZ e Y.-XL diseñaron el proyecto y proporcionaron financiación; WD realizó todos los análisis de datos; SW y XS recolectaron muestras y aislaron cepas bacterianas; PQ, SF, PC, JL, HC, YS, YW y MW realizaron experimentos; Y.-ZZ y H.-HF proporcionaron directrices y comentarios; WZ escribió el artículo.

Correspondencia a Yong-Xin Li o Weipeng Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Christian Jogler, Irene Wagner-Döbler y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ding, W., Wang, S., Qin, P. et al. La oxidación anaeróbica de tiosulfato por parte del grupo Roseobacter prevalece en las biopelículas marinas. Nat Comuna 14, 2033 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37759-4

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Recibido: 22 de septiembre de 2022

Aceptado: 30 de marzo de 2023

Publicado: 11 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37759-4

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