Corrosión del acero influenciada microbiológicamente en agua de mar superficial costera contaminada por petróleo crudo

npj Materials Degradation volumen 6, Número de artículo: 35 (2022) Citar este artículo

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Los hidrocarburos de petróleo derramados en el agua de mar superficial pueden representar amenazas potenciales para la corrosión de las infraestructuras de acero. Mostramos que el petróleo crudo aceleró la corrosión del acero principalmente acelerando la corrosión influenciada microbiológicamente (MIC). El petróleo crudo condujo al predominio de degradadores de petróleo marino, incluidos Alcanivorax y Marinobacter, tanto en el agua de mar como en la oxidación del acero, en lugar de las bacterias reductoras de sulfato (SRB), que dominaron la comunidad microbiana de la oxidación en el grupo sin petróleo. El petróleo crudo no solo mejoró la respiración microbiana de oxígeno y la degradación aeróbica de los hidrocarburos, sino también la reducción de nitratos y el proceso de degradación anaeróbica de los hidrocarburos en la oxidación del acero, lo que indica que se forman microambientes más heterogéneos en las superficies del acero. Además, la baja abundancia de SRB y del gen de reducción de sulfato disimilatorio (dsr), y la existencia de minerales de carbonato de hierro y sulfato de hierro implicaban que el sulfuro microbiano, anteriormente considerado como la principal causa de MIC, no era el principal contribuyente a la corrosión del acero. en aguas de mar contaminadas tempranamente con petróleo. Los degradadores de petróleo marinos especializados parecen desempeñar papeles más importantes en tales condiciones.

La corrosión de materiales a base de hierro en entornos que contienen petróleo, como campos de petróleo y gas, es un gran problema para la confiabilidad de las infraestructuras industriales en todo el mundo. Solo en China, se estima que el costo total de la corrosión directa en la industria del petróleo y el gas alcanzará el 2,82 % del valor total de la producción en 20141. En ambientes marinos, la corrosión de los materiales metálicos expuestos a sustancias que contienen petróleo y sulfatos. El agua de mar rica durante el proceso de producción y transporte de petróleo ha atraído gran atención debido al deterioro nocivo del yacimiento y la perforación del material, que se deben en gran medida a las actividades de comunidades microbianas complejas2,3. Estos efectos nocivos sobre materiales influenciados directa o indirectamente por microorganismos, dependen de las reacciones específicas entre microorganismos (bacterias reductoras de sulfato (SRB), bacterias productoras de ácido (APB), etc.)/materiales (metal, hormigón, etc.)/ Los medios (composición química y parámetros físicos como nutrientes, sulfatos y sulfuros) se denominan corrosión influenciada microbiológicamente (MIC)4,5.

Recientemente, la atención se ha centrado en el proceso MIC en condiciones que contienen petróleo, donde eventualmente se desarrollarán condiciones anaeróbicas en el ambiente marino, como oleoductos de transporte de petróleo, equipos de almacenamiento de petróleo y sistemas de lastre de combustible compensados con agua de mar6,7. En tales condiciones, la biodegradación anaeróbica de hidrocarburos, como los combustibles derivados del petróleo y los biocombustibles alternativos, se puede lograr de forma independiente mediante algunos degradadores de hidrocarburos especializados o de forma sintrófica mediante varios microbios funcionales. Los SRB son los actores clave involucrados en los procesos que causan la corrosión y la degradación de los hidrocarburos8. Por ejemplo, Desulfoglaeba alkanexedensa, una bacteria marina reductora de sulfato9, puede oxidar completamente los alcanos de forma independiente utilizando sulfato como aceptor terminal de electrones y producir sulfuro y ácidos orgánicos de bajo peso molecular que generalmente aceleran la corrosión del acero10,11,12. Por lo tanto, la reducción microbiana de sulfato realizada por SRB, que puede acelerarse mediante la degradación anaeróbica de hidrocarburos, se considera con frecuencia como la principal causa de MIC en estos entornos que contienen petróleo6,10,11. Sin embargo, algunos investigadores piensan que se exagera el papel de la SRB13 y que otros microbios funcionales como la APB son el principal factor causal14.

Para las infraestructuras de acero, otra condición de corrosión en entornos marinos de petróleo y agua de mar que no debe pasarse por alto es la superficie costera del agua de mar contaminada por hidrocarburos de petróleo, donde la degradación de los hidrocarburos se realiza principalmente de forma aeróbica15. Los hidrocarburos de petróleo son omnipresentes en los océanos, donde se estima que las filtraciones naturales y las actividades humanas, incluidas las descargas de agua de lastre de los petroleros y las fugas de plataformas petroleras marinas16, liberan anualmente entre 0,4 y 4,0 millones de toneladas de petróleo crudo en los ecosistemas oceánicos17. Se observó una gran cantidad de hidrocarburos de petróleo en la superficie del agua del mar y podría tener efectos extensos en los ecosistemas costeros18,19. Normalmente, la estructura de las comunidades microbianas autóctonas podría estar moldeada por el petróleo, que proporciona nutrientes adicionales para los microorganismos y contribuye al enriquecimiento de degradadores de petróleo específicos20,21,22. Una variedad de infraestructuras marinas de acero, especialmente puentes costeros y barcos en muelles petroleros, plataformas y oleoductos de transporte de exploración de petróleo y gas en alta mar, están expuestas a aguas marinas contaminadas con petróleo y proporcionan hábitats para microbios formadores de biopelículas23,24. Una vez expuestas al petróleo crudo, tanto la comunidad microbiana adherida como la planctónica se desplazarían21,22,24,25 y, por lo tanto, ejercerían influencia en los procesos de MIC. El cambio de la composición microbiana y el proceso de CIM causado por la contaminación del petróleo en tales condiciones aeróbicas puede ser diferente al de los ambientes anaeróbicos26,27. A pesar de la posibilidad, la MIC del acero en estas aguas marinas superficiales se ha descuidado en gran medida, dejando abiertas preguntas sobre cómo los microorganismos planctónicos y adheridos tuvieron éxito alrededor/sobre la superficie del acero, y cómo influyen en los procesos de MIC en las aguas marinas superficiales expuestas al petróleo.

Los estudios anteriores se realizaron principalmente utilizando microcosmos en condiciones de oxígeno estrictamente anaeróbicas o transitorias10,11,23,24. En este estudio, realizamos experimentos de microcosmos con/sin exposición a petróleo crudo en condiciones aeróbicas abiertas al aire, utilizando agua de mar natural de la superficie y lodo marino recolectado de los muelles petroleros como inóculos. Se analizaron los parámetros geoquímicos clave del agua de mar, los parámetros de corrosión, incluida la velocidad de corrosión y la mineralogía de un acero de uso común en aplicaciones marinas, y tanto la comunidad planctónica como la microbiana adjunta, para determinar los mecanismos de MIC en aguas de mar que contienen petróleo. Proponemos que el aumento de la producción metabólica ácida y los microambientes aeróbicos/anaeróbicos más heterogéneos formados en la superficie del acero, que son inducidos por los degradadores de petróleo marino Alcanivorax y Marinobacter, son los principales factores que contribuyen a la corrosión exacerbada del acero. Estos hallazgos ofrecen información sobre la comprensión de los efectos de los hidrocarburos en el proceso MIC en entornos marinos contaminados por petróleo, como los muelles petroleros.

Para confirmar la existencia de aguas marinas contaminadas con petróleo en entornos marinos naturales, se determinó el componente de hidrocarburos del agua superficial muestreada en un muelle petrolero del puerto de Qingdao (China). El espectrograma GC-MS mostró que algunos de los componentes del petróleo crudo, incluidos los n-alcanos y el butilfenol, se identificaron en el agua de mar del campo (Figura complementaria 1A). Además, el análisis in situ del bacterioplancton en el agua de mar costera (Fig. 5b) mostró que la abundancia relativa de degradadores de petróleo marino, especialmente Alcanivorax (3,2%) y Marinobacter (1,3%) en este muelle petrolero era mayor que eso (<0,01% ) en otras áreas marinas donde tomamos muestras28. Dado que las bacterias que degradan el petróleo suelen crecer y multiplicarse rápidamente en ambientes marinos impactados por el petróleo, podrían considerarse biomarcadores de contaminación por petróleo22. Estos resultados revelaron la existencia de una condición de corrosión del petróleo y el agua de mar en ambientes marinos naturales que no debe pasarse por alto.

Para determinar si el petróleo crudo cambió, se probaron los factores geoquímicos del agua de mar, el sulfato, el pH y las sustancias orgánicas de bajo peso molecular como principales indicadores geoquímicos (Fig. 1). La concentración de sulfato disminuyó en ambos ensayos. Pero el consumo de sulfato fue significativamente mayor (P <0,05) en los tres momentos en el grupo expuesto al petróleo crudo (grupo con petróleo) que en el grupo sin petróleo crudo (grupo sin petróleo) (Fig. 1A). Indica que el petróleo crudo estimuló el consumo de sulfato. El aumento del consumo de sulfato por parte del petróleo crudo también se observó en un estudio anterior sobre la corrosión del acero al carbono expuesto a biocombustibles en condiciones anaeróbicas de agua de mar11.

Cambios en la concentración de sulfato A en el agua de mar y el valor del pH B junto con el tiempo de incubación. C La concentración de ácidos y alcoholes orgánicos de bajo peso molecular después de 85 días de incubación. D Número de células de bacterias productoras de ácido (APB) y bacterias reductoras de sulfato (SRB) calculado utilizando métodos de enumeración MPN. “*” indicó las diferencias significativas entre grupos mediante pruebas t; “▾” indicó las sustancias no detectadas. “Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo. T1: 25 días; T2: 55 días; T3: 85 días. Las barras de error representan desviaciones estándar de tres muestras independientes de sistemas triplicados.

Aunque el valor del pH aumentó en ambos grupos de tratamiento, fue menor (P <0,05) en los grupos con aceite que en los grupos sin aceite el día 25 (Fig. 1B). El pH más bajo puede deberse a los ácidos orgánicos producidos por las bacterias planctónicas que degradan los hidrocarburos (Fig. 5). Luego, el valor de pH de los grupos con aceite aumentó de manera sostenible y superó el de los grupos sin aceite en el último momento de incubación (P <0,05). En el momento T3, se formaron ambientes anaeróbicos en la superficie del acero. En tales condiciones anaeróbicas, el sulfato fue utilizado por un aumento de SRB (en comparación con el del punto de tiempo T2, Fig. 5) como aceptor de electrones para la oxidación de carbono orgánico (hidrocarburos de petróleo, lactato, acetato, etc.) para producir H2S y HCO3. − 29. El H2S ácido puede precipitar como sulfuros de hierro en la superficie del acero, mientras que la mayor concentración de carbono orgánico en el grupo Con Aceite que en el grupo Sin Aceite en el momento T3 estimuló más HCO3− producido y liberado en el agua de mar que contribuyó al valor de pH más alto en el grupo Con aceite. El mismo fenómeno de aumento del valor del pH después de la adición de carbono orgánico también se observó en otros sistemas30,31.

Como productos de la degradación microbiana de hidrocarburos, también se examinaron ácidos orgánicos de bajo peso molecular y alcoholes después de 85 días de incubación (Fig. 1). En comparación con el grupo Con aceite, la mayoría de los ácidos orgánicos determinados, incluidos lactato, butirato y alcoholes, incluidos metanol, propanol y butanol, fueron más bajos o indetectables en el grupo Sin aceite (P <0,05). Esto sugiere que el proceso de degradación de los hidrocarburos fue estimulado por el petróleo crudo. Los alcoholes y ácidos orgánicos identificados en el estudio actual pueden ser los intermedios de la degradación aeróbica de los hidrocarburos o los productos finales de la degradación anaeróbica de los hidrocarburos por bacterias marinas que degradan el petróleo. La degradación aeróbica del petróleo suele ocurrir en la superficie del agua de mar y produce productos intermedios que incluyen alcoholes y ácidos orgánicos32. Por ejemplo, los alcanos, como componentes principales del petróleo crudo (Figura 1B complementaria), se degradan primero a alcoholes primarios y luego se oxidan a los aldehídos correspondientes. Estos aldehídos se convierten en ácidos grasos, que se procesan mediante betaoxidación y finalmente se oxidan a CO233. Además, junto con la formación de áreas anóxicas en la superficie del acero, la fermentación anaeróbica del petróleo crudo ocurriría dentro de estas áreas y produciría varias sustancias orgánicas de bajo peso molecular como productos finales, como lactato y butirato, lo que se observó en concentraciones más altas en nuestro estudio (Fig. 1C). La formación de estos intermedios ácidos ayudó a explicar la velocidad de corrosión acelerada del acero (Figs. 2 y 3).

“Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo; “Con Oil Ster.”: Control esterilizado con enmienda de petróleo crudo; “No Oil Ster.”: Control esterilizado sin petróleo crudo. Las barras de error representan las desviaciones estándar de cuatro placas de acero independientes.

La morfología de la superficie de las muestras de acero se visualizó mediante técnicas SEM y CLSM después de eliminar los productos de corrosión. Sa: Coeficiente de rugosidad. “Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo. T1: 25 días; T2: 55 días; T3: 85 días.

La cantidad de APB y SRB en el agua de mar se detectó mediante métodos de enumeración MPN (Fig. 1D). El número de APB aumentó de 10 células mL-1 en la etapa inicial a 103 células mL-1 en la última etapa de incubación cuando se expuso al petróleo crudo. Por el contrario, fue indetectable en el grupo No Oil. Indica que el petróleo crudo impulsó el crecimiento de la APB. Este resultado es consistente con el de la alta concentración de ácidos orgánicos (Fig. 1C). Por el contrario, el número de SRB planctónicos estuvo por debajo de los niveles detectables en ambos tratamientos. Esto es consistente con los resultados de que muy pocas secuencias del gen 16S rRNA estaban afiliadas a SRB. El mismo hallazgo también se demostró en un estudio anterior23. Este hallazgo no es sorprendente, ya que el ambiente aeróbico del agua de mar no era adecuado para el crecimiento anaeróbico de SRB hasta que se agotó el oxígeno en los sistemas cerrados (sin intercambio de gases)26. El consumo de sulfato fue estimulado por el petróleo crudo como se señaló anteriormente, pero la abundancia de planctónicos principales y SRB adheridos no fue estimulada por el petróleo crudo en el mismo momento (Figs. 1D y 5B). Esto indica que el planctónico y los SRB adheridos al agua de mar no fueron los principales contribuyentes al aumento del consumo de sulfato. Para determinar los contribuyentes reales en los simuladores de modificación de petróleo, se examinó más a fondo el número de SRB en los sedimentos. El resultado mostró que la cantidad de SRB en el sedimento fue mayor en el grupo con aceite que en el grupo sin aceite (3,15 × 102 frente a 2,74 × 102 células ml-1) después de 85 días de incubación. Esto implica claramente que el aumento de SRB en los sedimentos en lugar del agua de mar fue uno de los factores que contribuyeron al mayor consumo de sulfato observado en el agua de mar expuesta al petróleo.

Para determinar el efecto del petróleo crudo sobre la corrosión del acero, medimos la velocidad de corrosión midiendo la pérdida de peso del acero después de 85 días de incubación (Fig. 2). El acero expuesto al agua de mar sin petróleo crudo sufrió una tasa de corrosión promedio de 0,21 mm por año, mientras que el expuesto al agua de mar con petróleo crudo mostró una tasa de corrosión promedio de 0,29 mm por año. Así, la adición de petróleo crudo estimuló significativamente la corrosión del acero (P < 0,05). Se establecieron grupos esterilizados con/sin petróleo crudo para evaluar el efecto de la MIC sobre la corrosión del acero. La tasa de corrosión de ambos grupos esterilizados fue de 0,07 mm por año (P > 0,1). Sin embargo, fue significativamente menor que la tasa de corrosión del acero en grupos no esterilizados. Obviamente, el petróleo crudo no podría acelerar la corrosión del acero a menos que intervengan microorganismos. Es decir, el petróleo crudo mejoró la corrosión del acero principalmente estimulando el crecimiento y la actividad de microorganismos.

Para describir mejor las características de los productos de corrosión, SEM y CLSM analizaron la morfología de la superficie del acero corroído (Fig. 3). Se observaron diferencias claras entre el grupo Sin Aceite y el grupo Con Aceite. En el momento T1, el ataque por picaduras en la superficie del acero en los grupos era evidente, pero la profundidad máxima de las picaduras de corrosión en el grupo Sin Aceite fue de 16,1 μm (profundidad promedio 10,6 μm), que fue mayor que la del grupo Con Aceite (profundidad máxima 10,6 μm). profundidad 8,8 μm, profundidad media 8,1 μm). El valor de rugosidad del acero en el grupo Sin Aceite (1,05 μm) también fue mayor que en el grupo Con Aceite (0,92 μm). Estos últimos tenían fosas más densas. En el momento T2, la profundidad máxima de las picaduras de corrosión aumentó a 31,7 μm (profundidad promedio 27,4 μm) y las pequeñas picaduras se convirtieron en agujeros grandes (391,8 μm) en el grupo Sin aceite, que eran aún más altos que en el grupo Con aceite ( profundidad máxima 20,1 μm, profundidad media 17,6 μm, tamaño de poro 83,3 μm). El acero en el grupo Sin Aceite (4,12 μm) era más rugoso que el del grupo Con Aceite (1,72 μm). Sin embargo, la corrosión parecía más severa en el grupo Con Aceite que en el grupo Sin Aceite al final del experimento (T3): la profundidad de las picaduras de corrosión formadas en el grupo Con Aceite (máximo 54,2 μm, profundidad promedio 35,8 μm) excedió la del grupo Sin Aceite. Grupo de petróleo (máximo 49,4 μm, profundidad media 28,9 μm); La morfología de la corrosión del acero en el grupo With Oil pareció convertirse en una corrosión uniforme más severa. Un fenómeno similar, en el que la superficie del acero mostraba la corrosión localizada más evidente, también se encontró en simuladores de agua de mar después de 14 semanas de exposición al petróleo34. En comparación con el acero en microcosmos en condiciones anaeróbicas (> 1000 μm)11, la profundidad máxima de picaduras observada en estos microcosmos aeróbicos (< 100 μm) fue mucho menor. En conjunto, estos resultados sugirieron que el petróleo crudo mejoró la velocidad de corrosión promedio, y la corrosión localizada pareció inhibirse en la etapa de exposición inicial pero finalmente estimulada en la etapa de exposición posterior.

Para analizar los efectos potenciales de la exposición al petróleo en la formación de productos de corrosión, se utilizaron técnicas espectroscópicas y microscópicas para observar la morfología y determinar la composición de los productos de corrosión formados al final de la incubación (Fig. 4). Se observó que los microbios en forma de varilla y espiral estaban asociados con los productos de corrosión, y algunos estaban cubiertos por productos de corrosión (flecha blanca en la Fig. 4A, C) en simuladores con y sin petróleo crudo. El análisis EDS mostró que alrededor de estos microbios se observaron compuestos con alto contenido de oxígeno, hierro y azufre pero con diferentes formas (Fig. 4B, D). Esto implicaba que los microbios tenían una estrecha relación con la formación de productos de corrosión. Además, solo se detectó manganeso en superficies de acero en el grupo Sin aceite (Fig. 4B, D), lo que indica que el manganeso en el acero estaba disuelto. Esto puede ser causado por bacterias oxidantes de manganeso como Bacillus y Actinobacteria (datos no mostrados) en las comunidades microbianas adjuntas. Como las bacterias oxidantes de manganeso pueden cooperar con las SRB para causar una corrosión severa del acero35, la mayor abundancia de SRB en el grupo sin aceite puede indicar una cooperación más fuerte con las bacterias oxidantes de manganeso que aceleran la disolución del manganeso del acero en comparación con la del grupo con aceite. .

Imágenes SEM con vista de gran aumento de productos de corrosión y microbios con (A) y sin (C) petróleo crudo. Espectros EDS de productos típicos de corrosión con (B) y sin (D) petróleo crudo. Los rectángulos blancos representan las áreas correspondientes para el análisis EDS. Las flechas blancas representan microbios adheridos. Análisis E XRD de productos de corrosión representativos. Se observaron picos de difracción indicativos para las fases clave de corrosión del Fe. “Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo.

Como se muestra en la Fig. 4E, los productos de corrosión formados en el grupo No Oil estaban compuestos principalmente de mackinawita (FeS), ferrihidrita (FeO (OH)), óxido de hierro (Fe2O3, Fe3O4 y FeO) e hidróxido de hierro (Fe (OH) 2. ). En comparación, los productos de corrosión en el grupo Con aceite estaban compuestos de carbonato de hierro (FeCO3 y Fe2O2CO3) y sulfato de hierro (Fe2(SO4)3 y FeSO3∙2.5 H2O), además de los mismos productos de corrosión como sulfuro de hierro (FeS), Óxido de hierro (Fe2O3 y Fe3O4) identificado en el grupo No Oil. La presencia de sulfato de hierro podría indicar la actividad activa de APB en la formación de productos de corrosión, ya que APB podría producir activamente sulfato/sulfito. También se ha observado anteriormente que el sulfato de hierro es un importante producto de corrosión en un tanque de almacenamiento de nafta36. Además, como el carbonato de hierro podría convertirse en FeS mediante sulfuro37, la identificación del carbonato de hierro en el grupo Con petróleo en lugar del grupo Sin petróleo reflejó indirectamente el contenido relativamente bajo de sulfuro en la superficie del acero expuesta al petróleo crudo. Debido a que la presencia de sulfuro de hierro podría considerarse como un indicador de corrosión influenciada por SRB4,38, la identificación de carbonato de hierro en este estudio (Fig. 4E) podría implicar una influencia relativamente débil de SRB en la corrosión del acero cuando se expone al petróleo crudo.

En total, se obtuvieron ~1.440.567 etiquetas efectivas de genes bacterianos de ARNr 16S con una longitud promedio de ~412 pb para análisis posteriores y se adquirieron 38.184 unidades taxonómicas operativas (OTU). Para identificar diferencias en la diversidad α, se utilizó la riqueza de especies revelada por el índice ACE y Chao1, la diversidad revelada por el índice de Shannon y Simpson entre estos cuatro grupos (comunidad microbiana planctónica sin petróleo crudo, comunidad microbiana planctónica con petróleo crudo, comunidad microbiana de superficie sin petróleo crudo , comunidad microbiana de superficie con petróleo crudo) en diferentes etapas (Figura complementaria 2). Para las comunidades microbianas planctónicas, el grupo With Oil tuvo un valor promedio más alto de ACE y el índice Chao1, pero un valor más bajo del índice de Shannon y Simpson. Dado que los índices de Shannon y Simpson son estimadores integrales de diversidad que dan riqueza y uniformidad de especies, el valor de contraste de ACE/Chao1 más alto pero Shannon/Simpson más bajo podría explicarse por la menor uniformidad de especies en el grupo With Oil. Para la comunidad microbiana adjunta, la riqueza de especies del grupo Con Aceite fue mayor (ACE, 2180; Chao1, 2040) en la etapa inicial, pero disminuyó a un nivel más bajo en la última etapa (ACE, 2054; Chao1, 1959). que el grupo No Oil (ACE, 2587; Chao1, 2488). Toda la diversidad microbiana mostrada por el índice de Shannon y Simpson tuvo una tendencia similar. El fenómeno de que la exposición al petróleo indujo una reducción en la diversidad bacteriana estuvo de acuerdo con estudios previos, en los que las bacterias que degradan los hidrocarburos se convirtieron en las respuestas dominantes a la contaminación por petróleo en ambientes contaminantes como las playas y el suelo de las marismas39,40. En resumen, el tratamiento con aceite redujo la diversidad planctónica y bacteriana adjunta después de una simulación de 85 días, lo que puede explicarse por la fuerte selección de bacterias especializadas en degradación de hidrocarburos22,39 como Alcanivorax sp. y Marinobacter sp. (Fig. 5B) en el presente estudio.

Análisis de composición a nivel de filo (o clase) y nivel de género B de secuencias del gen 16S rRNA bacteriano superior para muestras de agua de mar y de superficie. El cladograma de taxones discriminatorios identificados en los grupos con/sin petróleo crudo desde el día 85 (T3) mediante análisis LEfSe (Análisis discriminante lineal (LDA), puntuación logarítmica > 3,5, P = 0,05). C Las comunidades microbianas planctónicas del día 0 (T0) y el día 85 (T3), y D las comunidades microbianas adjuntas del día 25 (T1), el día 55 (T2) y el día 85 (T3) se determinaron en microcosmos de laboratorio con/sin petróleo crudo. La abundancia relativa de cada taxonomía fue el valor promedio por triplicado. “Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo.

Con respecto a la asignación taxonómica a nivel de filo (o clase) que se muestra en la Fig. 5A, Gammaproteobacteria (38,8%) y Alphaproteobacteria (36,0%) fueron las dos clases planctónicas predominantes en el agua de mar original (T0). Después de la inmersión de placas X70 en agua de mar durante 85 días (T3) sin petróleo crudo, la abundancia relativa de gammaproteobacterias aumentó ligeramente del 38,8% al 43,0% y las alfaproteobacterias disminuyeron del 36,0% al 22,2%. La abundancia relativa de gammaproteobacterias en el grupo con aceite aumentó significativamente del 38,8% al 61,2% en comparación con la del grupo sin aceite, mientras que el contenido de alfaproteobacterias disminuyó obviamente del 36,0% al 14,7%. También se observaron resultados similares a nivel de género como se muestra en la Fig. 5B. El agua de mar costera original sólo contenía una pequeña proporción de microbios que degradaban los hidrocarburos. Después de estar expuestos al petróleo crudo durante 85 días, la abundancia relativa de microorganismos degradantes del petróleo pertenecientes a las gammaproteobacterias aumentó significativamente, especialmente Alcanivorax del 3,2% al 27,2% y Marinobacter del 1,3% al 5,9%, respectivamente. Alcanivorax tiene una presencia generalizada en todo el océano debido a su capacidad de utilizar una variedad de alcanos saturados en el petróleo crudo (p. ej., n-alcanos e isoalcanos que se muestran en la figura complementaria 1) de manera más efectiva que otras bacterias que degradan los hidrocarburos. Así, este género suele actuar como colonizador temprano y convertirse en el predominante tras la enmienda del petróleo crudo en ambientes marinos naturales41. Este fenómeno ha sido confirmado en este estudio (Fig. 5B). Marinobacter es también uno de los degradadores de petróleo conocidos en los océanos contaminados por petróleo y muestra cantidades moderadas de degradación de petróleo en comparación con el alto potencial de degradación de petróleo de Alcanivorax18. La rápida respuesta de las bacterias marinas que degradan los hidrocarburos al petróleo implicó que se debería tener en cuenta su papel en la corrosión del acero, dados los crecientes casos de contaminación por petróleo en las zonas costeras del mar.

LEfSe se empleó además para identificar taxones planctónicos específicos que se enriquecieron en cada grupo en la última etapa de cultivo (T3). Los resultados se muestran en la Fig. 5C. La exposición al petróleo indujo una mayor abundancia del orden Oceanospirillales (35%) en el grupo Con Petróleo (T3 con Petróleo). Pertenece a Gammaproteobacteria e incluye los géneros Alcanivorax (el mencionado anteriormente), Marinobacterium, Oleibacter y Oleiphilus identificados en el presente estudio. Los miembros de los océanospirillales pueden moverse mediante quimiotaxis y degradar los alcanos, lo que les permite agregarse activamente y aumentar en número rápidamente en entornos marinos contaminados por petróleo42. El género Cycloclasticus (3%) fue otro taxón planctónico específico en el grupo With Oil (Fig. 5B, C). Cycloclasticus tiene un papel importante en la eliminación de hidrocarburos aromáticos que también eran componentes importantes del petróleo crudo (Figura complementaria 1B). Suele aparecer en la última etapa de los casos contaminados con petróleo, momento en el que la mayoría de los alcanos saturados se han degradado y quedan hidrocarburos aromáticos persistentes. Cycloclasticus solo se detectó en una concentración alta después de 85 días (Fig. 5B), y también se detectó después de un período de muestreo similar en algunas otras áreas marinas donde hubo derrames de petróleo43.

Curiosamente, el grupo Sin Aceite (T3 sin Aceite) mostró un aumento de taxones discriminatorios que tienen un alto requerimiento de hierro para el crecimiento, como Magnetovibrio y Nitrosomonas44,45. Magnetovibrio (6%) pertenece a Alphaproteobacteria y es un tipo de género magnetotáctico típico con magnetosomas intracelulares. Algunos miembros dentro de Magnetovibrio exhiben crecimiento quimiolitoautotrófico en sulfuro con oxígeno como aceptor terminal de electrones y/o crecimiento quimioorganoheterotrófico en varios ácidos orgánicos44. Estos grupos de microorganismos también fueron detectados en este estudio (Fig. 1C). Su motilidad mediante flagelos polares les permite consumir de forma activa el carbono y las sustancias energéticas del agua de mar.

En conjunto, estos resultados sugieren que la adición de petróleo crudo cambió la comunidad microbiana planctónica alrededor del acero y estimuló significativamente el crecimiento de microorganismos marinos que degradan el petróleo, mientras que la única introducción de acero en el agua de mar estimuló microbios que tienen un alto requerimiento de hierro.

Los grupos microbianos dominantes de la comunidad microbiana adherida al acero eran diferentes a los de la planctónica. En comparación con el predominio de Gammaproteobacteria en las comunidades microbianas planctónicas, las Deltaproteobacteria tuvieron una mayor abundancia en las comunidades microbianas de superficie e incluso se convirtieron en el filo más abundante en la comunidad microbiana de superficie en el grupo With Oil (Fig. 5A). Por el contrario, la abundancia de Deltaproteobacterias predominantes disminuyó con el tiempo en el grupo Sin Aceite, mientras que las Deltaproteobacterias aumentaron gradualmente en el grupo Con Aceite. Esta observación fue diferente de un estudio anterior, que mostró que el cambio de comunidad de Gammaproteobacteria a Alphaproteobacteria se observó después de 2 semanas de exposición al petróleo34. La discrepancia puede deberse a la presencia de sedimentos como una de las fuentes de taxones en el presente diseño experimental.

A nivel de género, Desulfovibrio perteneciente a Deltaproteobacteria se detectó como el género más abundante en el grupo No Oil, representando el 65,8%, 34,7%, 25,9% en T1, T2 y T3, respectivamente (Fig. 5B). Desulfovibrio es uno de los SRB representativos que generalmente se observan como el género predominante en la corrosión formada en ambientes marinos28,46. Se ha demostrado que es la principal causa de corrosión bacteriana marina47,48. Sin embargo, la modificación del petróleo crudo en agua de mar cambió el predominio de Desulfovibrio a Alcanivorax en las etapas iniciales (T1 y T2 con Petróleo, Fig. 5). Como el hierro es un componente importante para que las células de Alcanivorax sinteticen una variedad de oxigenasas responsables de la activación de alcanos y hemo que contiene hierro para proteger las células contra el estrés oxidativo, las células de Alcanivorax poseen un sistema de absorción de hierro de alto rendimiento que consiste en sideróforo y un tipo extracelular de hierro. -molécula quelante para proporcionar el hierro necesario a las células49,50. La capacidad de absorción de hierro y formación de biopelículas51 puede explicar por qué Alcanivorax dominaba las comunidades bacterianas adheridas. Por primera vez, este estudio reveló que los degradadores de petróleo, Alcanivorax y Marinobacter, dominaban la comunidad microbiana de la superficie del acero y pueden contribuir en gran medida al proceso de corrosión en el agua de mar contaminada por petróleo.

Se utilizó LEfSe para identificar los colonizadores de superficie específicos en las últimas fases de incubación. Como se muestra en la Fig. 5D, la familia Marinobacteraceae, incluido el género Marinobacter, y la familia Alcanivoracaceae, incluido Alcanivorax, se enriquecieron significativamente en el grupo Con aceite, mientras que la familia Desulfurivibrionaceae, incluido Desulfovibrio, y la familia Flavobacteriaceae, incluido Lutibacter, se enriquecieron en el grupo Sin aceite. Un estudio previo demostró que los miembros de Flavobacteriaceae mostraban sistemas de absorción de Fe altamente competitivos entre los procariotas marinos52, lo que puede explicar su enriquecimiento en la comunidad microbiana de la superficie del acero.

En conjunto, el petróleo crudo indujo impactos diferentes pero sostenidos en la composición de la comunidad microbiana de la superficie en comparación con la comunidad microbiana planctónica. El petróleo crudo agregado proporcionó una fuente importante de carbono y energía en un ambiente de agua de mar que de otro modo estaría privado de nutrientes, lo que estimuló el crecimiento de los microbios que degradan el petróleo adheridos inicialmente a la superficie del acero en lugar de SRB. Junto con la degradación y el consumo de petróleo crudo, la abundancia de degradadores de petróleo comenzó a disminuir y la SRB comenzó a aumentar con el tiempo.

Para identificar mejor las funciones de la comunidad planctónica y microbiana adjunta bajo la exposición al petróleo crudo, analizamos los genes funcionales utilizando la predicción PICRUSt. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se encontró que la comunidad microbiana de la superficie tuvo una respuesta diferente a la enmienda de petróleo crudo en comparación con la comunidad microbiana planctónica (Fig. 6A, B). Para la comunidad microbiana planctónica (Fig. 6A), el procesamiento de información genética como la biogénesis de ribosomas, las chaperonas y la catálisis de plegamiento, el plegamiento de proteínas y las proteínas de traducción fueron fuertemente estimulados por el petróleo crudo. De manera diferente, el metabolismo de los aminoácidos (incluido el metabolismo de la arginina, la prolina, la lisina y la beta-alanina, la degradación de la valina, la leucina y la isoleucina), el metabolismo de los lípidos (incluido el metabolismo de los ácidos grasos y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados) y el metabolismo de los carbohidratos (incluido el metabolismo del butanoato y el propanoato). ) de la comunidad microbiana adherida a las superficies de acero fueron estimuladas por petróleo crudo (Fig. 6B). Además, la biodegradación y el metabolismo de los xenobióticos, incluida la degradación de benzoato, aminobenzoato, naftaleno, cloroalcano y cloroalqueno, se promovieron en las muestras de superficie con la adición de petróleo crudo. Esto indicó que el petróleo crudo tenía cierto efecto sobre las vías funcionales de las comunidades microbianas planctónicas y adheridas de manera diferente.

A Las vías funcionales de la comunidad microbiana planctónica y B la comunidad microbiana adjunta que se enriqueció significativamente en grupos con/sin petróleo crudo durante 85 días (T3). La columna de la izquierda mostró la abundancia relativa de cada vía y la columna de la derecha mostró la diferencia entre grupos. C La abundancia de genes funcionales importantes de las comunidades planctónicas y microbianas adjuntas desde el día 0 (T0), el día 25 (T1), el día 55 (T2) y el día 85 (T3). Las diferencias significativas (P <0,05) se analizaron mediante la prueba T; "▾" y "*" indicaron genes significativamente diferentes entre grupos con/sin petróleo crudo de muestras planctónicas y adjuntas durante 85 días (T3), respectivamente. “Con Petróleo”: Con enmienda de petróleo crudo; “No Oil”: Sin petróleo crudo.

El petróleo crudo estimuló el metabolismo energético tanto del metabolismo planctónico como del adjunto. Por lo tanto, se identificaron aún más los genes funcionales clave relacionados con la aceptación terminal de electrones y la degradación de hidrocarburos. Como se muestra en la Fig. 6C, se observó que los genes relacionados con la respiración de oxígeno (cox y cco), la desnitrificación (nar y nap), el hierro (mtr) y la reducción de sulfato (dsr) se identificaron tanto en muestras de agua de mar como de superficie. Pero sólo los genes cox y nar se enriquecieron significativamente (P <0,05) en muestras de superficie expuestas al petróleo crudo. Por el contrario, el gen cox en el agua de mar se redujo significativamente (P <0,05) debido a la enmienda de aceite. Esta observación indicó que el petróleo crudo estimuló la respiración microbiana de oxígeno y el proceso de desnitrificación de la comunidad microbiana adjunta, pero debilitó la respiración de oxígeno de las comunidades microbianas planctónicas. La mejora de los modos de respiración aeróbicos y anaeróbicos en la superficie del acero puede deberse a la formación de microambientes aeróbicos y anaeróbicos heterogéneos dentro de los productos de corrosión espesados y complicados, donde existían áreas tanto aeróbicas como anaeróbicas. El proceso de desnitrificación microbiana podría ocurrir en tales condiciones anaeróbicas, lo que también se observó previamente en zonas anóxicas con petróleo en ambientes marinos53,54. Los microbios adheridos dominantes, como Alcanivorax sp. y Marinobacter sp. con capacidad de crecimiento anaeróbico a través del proceso de desnitrificación55,56, fueron muy probablemente responsables del proceso de desnitrificación de la comunidad microbiana adjunta.

No es sorprendente que el gen clave dsr relacionado con el proceso de reducción de sulfato disimilatorio no fuera estimulado significativamente en el grupo Con Aceite en comparación con el grupo Sin Aceite (P > 0,5) (Fig. 6C), lo cual fue consistente con el análisis taxonómico (Fig. 5). ). Por el contrario, genes clave como cys implicados en la reducción asimilatoria de sulfato se enriquecieron significativamente en el grupo Con Aceite (P <0,5). Como se consumió más sulfato en el grupo Con aceite que en el grupo Sin aceite, propusimos que la reducción disimilatoria de sulfato por SRB no era la causa principal del consumo de sulfato. La reducción de sulfato por asimilación microbiana puede promover en gran medida el consumo de sulfato en los sedimentos.

Los genes relacionados con la degradación aeróbica de los hidrocarburos para las comunidades planctónicas y microbianas adheridas fueron mejorados por el petróleo crudo, especialmente los genes relacionados con la degradación de alcanos (alk), alcohol (adh) y ácidos grasos (fad) (P <0,5) (Fig. 6C). . Los genes relacionados con la degradación de aldehídos (aldh) solo se enriquecieron significativamente en las superficies de acero (P <0,5), lo que sugiere la posible formación de ácidos grasos. Aunque en baja abundancia, también se observaron genes relacionados con la degradación anaeróbica de hidrocarburos (Fig. 6C). Esto también es de esperarse porque la degradación anaeróbica de los hidrocarburos suele considerarse varios órdenes de magnitud más lenta que la degradación aeróbica de los hidrocarburos57. A pesar de la baja abundancia, el gen bcr relacionado con el benzoato, que es importante para la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos58, fue facilitado significativamente por el petróleo crudo en la superficie del acero (P <0,5). La fermentación anaeróbica de hidrocarburos generalmente produce una variedad de ácidos orgánicos de bajo peso molecular, que se observaron en concentraciones más altas en el agua de mar circundante con petróleo crudo que en los grupos de control (Fig. 1C). Esto implica que la fermentación anaeróbica también contribuye a la corrosión acelerada del acero.

Experimentos de laboratorio anteriores realizados con agua de mar costera han demostrado que la enmienda de hidrocarburos, incluidos combustibles derivados del petróleo24 y combustibles alternativos11,13, podría acelerar la corrosión del acero. En esos estudios se observó un mayor consumo de sulfato y producción de sulfuro junto con una mayor tasa de corrosión. Por lo tanto, se creía que la corrosión del acero era el resultado de la producción de sulfuro biogénico estimulada por la degradación anaeróbica o aeróbica de los hidrocarburos11,23,24,26. En el presente estudio, también se observó un fenómeno similar de mayor consumo de sulfato y corrosión más severa en microcosmos con agua de mar con enmienda de petróleo crudo que en aquellos sin petróleo crudo. Sin embargo, la menor abundancia de SRB y el gen clave correspondiente dsr en las comunidades microbianas adheridas y planctónicas expuestas al petróleo crudo implicaba que el papel de la producción microbiana de sulfuro en la corrosión del acero no era tan importante como en ambientes anaeróbicos. El mayor consumo de sulfato y la débil reducción microbiana de sulfato en el agua de mar parecen lo contrario. Esto puede explicarse por el ambiente aeróbico durante todas las etapas de incubación y el uso tanto de agua de mar como de sedimento como inóculo. Debido a que el agua de mar aeróbica no era adecuada para el crecimiento de SRB, el sedimento en los simuladores proporcionó ambientes anaeróbicos para SRB que indujeron la reducción de sulfato en el agua de mar. El mayor número de SRB en los sedimentos del grupo de exposición al petróleo crudo lo confirmó. La genética cys significativamente estimulada por el petróleo crudo en el agua de mar y en la superficie sugiere que la reducción de sulfato asimilatorio también puede contribuir al consumo de sulfato en el agua de mar. Por lo tanto, los datos sobre el consumo de sulfato no necesariamente respaldan la suposición de que la reducción microbiana de sulfato por disimilación fue la principal causa de la corrosión del MIC del acero en condiciones marinas de contaminación por petróleo crudo.

Por lo tanto, proponemos que las bacterias que degradan los hidrocarburos, en lugar de las SRB, sean las principales contribuyentes de MIC en la etapa inicial de la contaminación por petróleo crudo en el agua de mar superficial. Aunque su abundancia era baja en el agua de mar costera original, las bacterias degradantes de hidrocarburos como Alcanivorax y Marinobacter aumentaron rápidamente una vez que se produjo la intrusión del petróleo crudo y dominaron tanto la comunidad microbiana planctónica como la de superficie después de 25 días de exposición. Estos taxones pueden adherirse a las superficies de acero y contribuir a la formación de biopelículas. En el período inicial (0 a 55 días), la degradación aeróbica de hidrocarburos fue la principal actividad realizada por los degradadores de petróleo dominantes. El producto final de la degradación microbiana aeróbica completa de los hidrocarburos es el CO2, que genera menos amenaza de corrosión por picaduras que el sulfuro corrosivo producido por SRB6,26 en comparación con el del grupo No Oil. Esto puede explicar por qué la corrosión por picaduras parece inhibirse en la etapa inicial.

Junto con la maduración de la biopelícula y la formación de productos de corrosión, se formaron microambientes heterogéneos con áreas óxicas y anóxicas en las superficies de acero. Esto se confirma además por los genes fortalecidos relacionados con la respiración de O2 y los genes anaeróbicos relacionados con la reducción de NO3. La heterogeneidad de los microambientes de la superficie formados principalmente por estas bacterias degradantes de hidrocarburos puede conducir a la formación de zonas de corrosión, lo que se denomina celda de concentración de oxígeno, que contiene áreas catódicas (altas concentraciones de oxígeno disuelto) y anódicas (bajas concentraciones de oxígeno disuelto)59. La respiración microbiana estimulada por O2 implicó que el O2 también desempeña un papel en la aceleración de la corrosión. En presencia de O2, el sulfuro de hierro unido a la superficie se oxida y tienen lugar más reacciones superficiales, mientras que en ausencia de oxígeno la corrosión será lenta a medida que los iones superficiales se derivatizan60. Estos factores aceleran la corrosión del acero en agua de mar que contiene petróleo.

Otra causa de la corrosión acelerada del acero son los ácidos orgánicos producidos. Algunos miembros de degradadores de hidrocarburos como Alcanivorax sp. puede realizar una fermentación anaeróbica del aceite55 dentro de las áreas anóxicas de la superficie en el período posterior (55 a 85 días). Esto fue respaldado por la detección de genes relacionados con la degradación de hidrocarburos anaeróbicos (Fig. 6C) y los productos de corrosión de carbonato de hierro (Fig. 4). La fermentación anaeróbica microbiana produce como productos finales una serie de sustancias orgánicas de bajo peso molecular, como el lactato y el butirato, que se detectaron en altas concentraciones en el agua de mar (Fig. 1C). Estos ácidos orgánicos pueden acelerar la corrosión del acero al destruir la capa protectora de óxido basada en los microambientes ácidos locales61 y proporcionar fuentes de carbono para el crecimiento de SRB que se observó que aumentaban durante el tiempo de incubación. Los factores anteriores contribuyen a la corrosión uniforme y localizada acelerada que se observa en las últimas etapas de incubación. Estos hallazgos proporcionan orientación para estudios sustanciales sobre la corrosión del acero en aguas de mar contaminadas con hidrocarburos de petróleo.

Se recogió y almacenó en botellas esterilizadas agua de mar de la superficie costera que se utilizó como medio y fuente de inóculo de un muelle petrolero (120,24°E, 35,98°N) en el puerto de Qingdao, China. Dado que los sedimentos marinos podrían ser la principal fuente de taxones en las biopelículas formadas sobre superficies de acero, como se ha demostrado en estudios de campo previos62, también se recolectaron sedimentos superficiales de los mismos sitios de muestreo mediante una cuchara de fondo. Las muestras de agua de mar y sedimentos se guardaron en cajas de hielo antes de transportarlas al laboratorio lo antes posible y se utilizaron para su tratamiento adicional dentro de las 24 h. Los componentes principales del petróleo crudo usado fueron n-alcano (66,7%), isoalcano (14,1%), naftaleno (8,23%), aromáticos (7,14%) y cicloalcano (3,77%) (Figura complementaria 1). Un acero marino de uso común, el acero X70, se fabricó en placas de 40 × 20 × 5 mm. La composición de X70 fue la siguiente (% en peso): C ≤ 0,16, Si ≤ 0,45, Mn ≤ 1,70, P ≤ 0,02, S ≤ 0,01, V ≤ 0,06, Nb ≤ 0,05, Ti ≤ 0,06, B ≤ 0,45, bal. Fe. La superficie de las placas X70 se pulió con papeles SiC de grano P120 a P800 y se limpió con etanol antes de secar en un horno. Las placas se pesaron y luego se almacenaron en un desecador sellado. Posteriormente, se esterilizaron adicionalmente mediante irradiación bajo una lámpara UV durante 30 minutos antes de comenzar los experimentos.

Para examinar el impacto de la exposición al petróleo crudo en la corrosión del acero, se crearon grupos de enmienda de petróleo crudo (con petróleo) y sin enmienda (sin petróleo) con agua de mar dulce y sedimentos. Se colocaron 1,5 L de agua de mar fresca y 0,5 L de sedimentos en botellas esterilizadas de 2 L que tenían puertos de muestreo ubicados en las fases de agua de mar y sedimento para su posterior muestreo. Se suspendieron placas de acero a una profundidad de 5 cm por debajo de la superficie del agua de mar. Se agregaron asépticamente cinco mililitros de petróleo crudo y el mismo volumen de agua esterilizada a la fase de agua de mar de los grupos Con Aceite y Sin Aceite usando jeringas estériles, respectivamente. Las botellas se sellaron con parafilm para permitir la entrada y salida del gas pero evitar la contaminación microbiana. Se establecieron como controles estériles los grupos de enmienda y no enmienda de aceite crudo con inóculos esterilizados en autoclave (121 °C durante 20 min; 20 psi). Se realizaron triplicados en cada grupo experimental. Todas las incubaciones se mantuvieron en ambientes oscuros a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) durante 85 días. Se analizaron series de tiempo (25, 55, 85 días) de los tratamientos para detectar factores geoquímicos dinámicos y comunidades bacterianas en respuesta a la adición de petróleo.

Para la detección de hidrocarburos en agua de mar original, las muestras de agua de mar se trataron previamente antes de la determinación mediante GC-MS (Agilent 7980A GC; MS: 5975C) (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.) como se describió anteriormente6. El proceso de pretratamiento fue el siguiente: se acidificaron 20 ml de agua de mar a pH 2 con HCl 6 N y se realizó la extracción utilizando el mismo volumen de acetato de etilo. Los hidrocarburos extraídos se concentraron a 100 μL, que luego se derivaron usando N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA). El pH y la concentración de sulfato del agua de mar en los tratamientos se detectaron después de 25, 55 y 85 días de incubación, respectivamente. El pH de cada tratamiento se determinó en flujo laminar luego de muestrear 3 mL de agua de mar de los simuladores. Para la detección de sulfato, se filtró 1 ml de agua de mar en cada tratamiento a través de membranas de filtro de 0,22 μm y luego se midió mediante espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). Las concentraciones de sustancias orgánicas de bajo peso en agua de mar filtrada después de 85 días de incubación se midieron utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) LC-20AT (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón).

Al final de la incubación, se recuperaron las placas analizadas. La morfología de la superficie y la composición de los elementos se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM, Zeiss Ultra 55, Alemania) con un espectrómetro de dispersión de energía (EDS, INCAx, Oxford, Reino Unido). La preparación de muestras para SEM y EDS se realizó según el estudio anterior63,64. Para una mayor determinación de los minerales cristalinos, se recogieron productos de corrosión de las superficies de acero, se secaron y se trituraron hasta obtener un polvo fino. Las muestras se analizaron mediante difracción de rayos X (XRD, Rigaku/max-Ultima IV, Japón) en las siguientes condiciones: radiación Cu Ka filtrada con grafito, 40 kV, 30 mA (λ = 0,1542 nm). Para medir la velocidad de corrosión, se eliminaron los productos de corrosión de las placas triplicadas de acuerdo con el estándar GB/T16545-2015 y las placas se pesaron nuevamente para determinar la pérdida de peso total. La tasa de corrosión general correspondiente (mm por año) se calculó a partir de datos de pérdida de peso según la norma ASTM G1-03. Para caracterizar el daño por corrosión localizado, las placas limpiadas se escanearon utilizando SEM y un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM) (LSM 510, Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Los números de SRB y APB cultivables en agua de mar se contaron utilizando la prueba de dilución del número más probable (MPN). La enumeración de SRB se realizó según el estándar GB/T14643.5-2009 con un medio SRB modificado. El medio de enumeración SRB contenía: 0,5 g de KH2PO4, 0,1 g de CaCl2·6H2O, 2,0 g de MgSO4·7H2O, 25 g de NaCl, 0,3 g de (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O, 0,1 g de vitamina C, 3,5 ml de lactato de sodio y 1,0 g de extracto de levadura en 1 litro de agua destilada con un valor de pH de 7,2 ± 0,2. La APB se enumeró utilizando caldo de dextrosa rojo fenol como se informó anteriormente65. El medio para APB contenía 10,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de carne, 5,0 g de glucosa y 0,018 g de rojo fenol en 1 litro de agua destilada con un valor de pH de 7,4 ± 0,1. Todas las enumeraciones de MPN se realizaron por triplicado diluyendo en serie 1 ml de muestra de agua en 9 ml de medio esterilizado. Estos tubos anaeróbicos llenos de medio de enumeración inoculado se mantuvieron a 30 °C durante 30 días y 3 días, respectivamente. Los tubos individuales obtuvieron una puntuación positiva para el crecimiento de SRB si el color del medio se volvió negro o para el crecimiento de APB si el color del medio cambió de rojo a amarillo.

Se utilizó la secuenciación del gen 16S rRNA para caracterizar las comunidades planctónicas y microbianas adjuntas. Para la detección de la comunidad microbiana planctónica, se recolectaron muestras de 400 ml de agua de mar en simuladores con y sin aceite y se concentraron en membranas de filtro de 0,22 μm al final de la incubación. Para la detección de la comunidad microbiana adherida, se tomaron muestras de biopelículas por triplicado (con algo de óxido) en la superficie del acero en los tres momentos (25, 55 y 85 días) mediante raspadores estériles. Una vez finalizado el muestreo, se extrajo el ADN genómico dentro de las 24 h utilizando un kit FastDNA SPIN para suelo (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ADN extraído se comprobó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop One (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.) y electroforesis en gel de agarosa (1%). Después de la construcción de bibliotecas de secuenciación como se informó anteriormente63, las muestras de biopelícula y agua de mar se secuenciaron por pares en la plataforma Illumina Novaseq PE250.

Los datos sin procesar se fusionaron usando FLASH (V1.2.7)66, se eliminaron las quimeras usando UCHIME67 y, posteriormente, se filtraron por calidad usando QIIME (V1.9.1)68. Se utilizó UPARSE (V7.0.1001)69 para agrupar las etiquetas efectivas obtenidas en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud del 97 %. Se seleccionaron secuencias representativas y se asignaron a la base de datos de ARNr de SSU57 para la anotación taxonómica (umbral 0,8–1) utilizando Mothur (V1.40.45)58. Para un análisis de diversidad adicional entre diferentes muestras, los datos de secuenciación se normalizaron al mismo número de lecturas en cada muestra. Los índices de diversidad alfa, incluidos Chao1, ACE, Shannon y Simpson, se calcularon en la plataforma QIIME. Los genes funcionales se anotaron en la base de datos KEGG70 en función de los datos de secuenciación utilizando PICRUSt71. El análisis discriminante lineal (LDA) basado en las pruebas de Kruskal-Wallis utilizando el software LEfSe (V1.0)39 indicó taxones (biomarcadores) significativamente diferentes enriquecidos en cada grupo con una puntuación LDA >3,5. Se utilizó la prueba T para determinar la diferencia en genes funcionales individuales entre diferentes tratamientos. P < 0,05 se consideró significativo.

Los datos de secuenciación de muestras de los sistemas de microcosmos se depositaron en la base de datos NCBI Short Read Archive (SRA) con el número de acceso de Bioproject PRJNA438021, con números de biomuestra SAMN22141952-22141979.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (No. ZR2021QD099), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No. 2021M690152) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 42076044, No. 41806090).

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Yimeng Zhang, Xiaofan Zhai, Fang Guan, Xucheng Dong, Jiawen Sun, Ruiyong Zhang, Jizhou Duan, Binbin Zhang y Baorong Hou

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Yimeng Zhang, Xiaofan Zhai, Fang Guan, Xucheng Dong, Jiawen Sun, Ruiyong Zhang, Jizhou Duan, Binbin Zhang y Baorong Hou

Centro de Megaciencia Oceánica, Academia China de Ciencias, Qingdao, China

Yimeng Zhang, Xiaofan Zhai, Fang Guan, Xucheng Dong, Jiawen Sun, Ruiyong Zhang, Jizhou Duan, Binbin Zhang y Baorong Hou

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YZ: Conceptualización, Metodología, Software, Investigación, Escritura—Borrador original; XZ, FG, XD, JS, BZ: Recursos, Visualización, Investigación; RZ: Metodología, Redacción—Borrador Original, Administración del Proyecto; JD: Conceptualización, Supervisión, Administración de proyectos, Adquisición de fondos; BH: Supervisión

Correspondencia a Ruiyong Zhang o Jizhou Duan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Zhang, Y., Zhai, X., Guan, F. et al. Corrosión del acero influenciada microbiológicamente en aguas de mar superficiales costeras contaminadas por petróleo crudo. npj Mater Degrad 6, 35 (2022). https://doi.org/10.1038/s41529-022-00242-4

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Recibido: 01 de diciembre de 2021

Aceptado: 15 de marzo de 2022

Publicado: 27 de abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41529-022-00242-4

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