Adaptación de alcohol polivinílico. - Ningbo SCR Catalyst Group Co., Ltd

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 20822 (2022) Citar este artículo

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Los catalizadores encapsulados en hidrogel son una herramienta atractiva para la intensificación de (bio)procesos de bajo costo. Los hidrogeles de alcohol polivinílico y alginato de sodio reticulados con ácido bórico y postcurados con sulfato (PVA-SA-BS) se han aplicado en procesos de bioproducción y tratamiento de agua, pero el bajo pH requerido para el entrecruzamiento puede afectar negativamente la funcionalidad del biocatalizador. Aquí, investigamos cómo el pH de reticulación (3, 4 y 5) y el tiempo (1, 2 y 8 h) afectan las propiedades fisicoquímicas, elásticas y de proceso de las perlas de PVA-SA-BS. En general, las propiedades de las perlas se vieron más afectadas por el pH de reticulación. Las perlas producidas a pH 3 y 4 eran más pequeñas y contenían cavidades internas más grandes, mientras que la tomografía de coherencia óptica sugirió que la densidad de reticulación del polímero era mayor. La elastografía de coherencia óptica reveló que las perlas de PVA-SA-BS producidas a pH 3 y 4 eran más rígidas que las perlas de pH 5. La liberación de azul de dextrano mostró que las perlas producidas con pH 3 permitían velocidades de difusión más altas y eran más porosas. Por último, durante una incubación de 28 días, las perlas de pH 3 y 4 perdieron más microesferas (como representantes celulares) que las perlas producidas a pH 5, mientras que estas últimas liberaron más material polimérico. En general, este estudio proporciona un camino a seguir para adaptar las propiedades de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS a una amplia gama de aplicaciones, como (bio)procesos químicos, enzimáticos y catalizados microbianamente.

Las perlas de hidrogel son una poderosa herramienta para la ingeniería de (bio)procesos. Estas matrices poliméricas hidratadas se pueden diseñar para encapsular catalizadores químicos, enzimáticos y microbianos vivos para impulsar las conversiones químicas deseadas1,2,3. Si bien los hidrogeles se pueden emplear de manera similar a las biopelículas granulares (o lodos granulares), ofrecen de manera única la posibilidad de combinar organismos con rasgos metabólicos complementarios para lograr las funcionalidades deseadas4,5. Además, adaptar el tamaño de las perlas de hidrogel puede optimizar el volumen catalítico efectivo de los bioprocesos y seleccionar poblaciones de interés específicas6,7. En conjunto, el potencial para minimizar la huella del proceso y la inversión de capital8 hace que los hidrogeles sean un lugar atractivo para la intensificación de bioprocesos9,10.

La composición del polímero y la química de reticulación son fundamentales en el desarrollo, diseño y aplicación de hidrogeles. El polímero seleccionado y su concentración final regirán las propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles, como la difusividad y las características viscoelásticas11,12,13,14. Estas propiedades son fundamentales para la eventual eficiencia y durabilidad de un proceso basado en hidrogel. Además, cuando se incluyen catalizadores microbianos en hidrogeles, se debe considerar la citotoxicidad de los monómeros de hidrogel y la química de entrecruzamiento para minimizar la pérdida celular15,16. De manera similar, la estructura a escala micrométrica de la matriz del hidrogel puede confinar a los microbios, lo que da como resultado hidrogeles abarrotados que alteran las propiedades fenotípicas de las células incrustadas y, finalmente, rompen el hidrogel17. En consecuencia, establecer enfoques para adaptar las propiedades fisicoquímicas de las perlas de hidrogel formadas por matrices no tóxicas conocidas puede mejorar significativamente su utilidad en la ingeniería de bioprocesos.

Dos polímeros de hidrogel ampliamente utilizados para encapsular catalizadores microbianos son el alginato de sodio (SA) y el alcohol polivinílico (PVA). El alginato es un polímero de carbohidrato natural que puede reticularse con iones Ca2+ (p. ej., en un baño de CaCl2), lo que proporciona un proceso de encapsulación con bajo estrés para los catalizadores microbianos18,19. Desafortunadamente, estos hidrogeles son mecánicamente débiles y se disuelven cuando se exponen a altas concentraciones de cationes monovalentes o quelantes de Ca como fosfato, citrato o EDTA20. Se ha demostrado que la combinación de reticulación de SA por Ca2+ con reticulación de PVA catalizada por ácido bórico a pH bajo produce perlas de hidrogel más robustas21. El PVA es un polímero de bajo costo que no es tóxico para las células microbianas22, lo que permite la aplicación exitosa de estos hidrogeles híbridos de PVA-SA en aplicaciones de bioprocesos e ingeniería ambiental10.

Para mejorar la aplicabilidad de estos hidrogeles de PVA-SA, se han desarrollado diferentes enfoques de adaptación. En primer lugar, la estabilidad mecánica y química de las perlas de PVA-SA se puede aumentar utilizando concentraciones más altas de PVA y ácido bórico durante la reticulación, aunque esto se produce a expensas de la difusividad de la matriz23,24. En segundo lugar, el poscurado de las perlas producidas con aniones que pueden reticular o mejorar las interacciones de enlaces de hidrógeno entre cadenas de PVA (p. ej., fosfato, sulfato) puede mejorar aún más las propiedades del hidrogel25,26. Se descubrió que el poscurado con sulfato era particularmente eficaz para producir perlas más fuertes y estables25,26. Según se informa, estos hidrogeles de PVA-SA-ácido bórico-SO42- (PVA-SA-BS) contienen poros de escala de 10 a 100 µm27,28 y tienen tasas de difusión muy altas para moléculas pequeñas29,30. En conjunto, las propiedades fisicoquímicas de estos PVA-SA-BS diseñados químicamente brindan potencial para aplicaciones de bioprocesos.

Un problema crítico con los procedimientos actuales para la producción de hidrogel PVA-SA-BS es que el bajo pH (~ 3) del bórico saturado es perjudicial para las células y a menudo requiere tiempos de recuperación de semanas después de la producción del hidrogel29,31. La producción de hidrogeles de PVA-SA-BS a un pH más cercano al neutro podría aumentar la tasa de supervivencia de los biocatalizadores y mejorar los tiempos de inicio del proceso, pero no está claro cuál es el impacto de un pH más alto en el mecanismo de reticulación catalizado por ácido. De manera similar, reducir el tiempo de exposición al ácido bórico también puede reducir el estrés celular27, pero puede afectar las propiedades críticas de las perlas producidas. Hasta la fecha, ningún estudio ha investigado exhaustivamente cómo el pH y la duración de la reticulación afectan las propiedades de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS resultantes. Además, los análisis multifacéticos de las propiedades físicas, mecánicas, químicas y de proceso de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS también están ausentes en la literatura a pesar de su interdependencia y la necesidad de comprender cómo los cambios en los parámetros de producción pueden inducir compensaciones en las propiedades deseables. Aquí, investigamos si el pH de reticulación (3, 4 y 5) y el tiempo (1, 2 y 8 h) alteran las propiedades de las perlas de hidrogel PVA-SA-BS, con la intención de desarrollar procedimientos simples para adaptar de manera predecible estos versátiles. , hidrogeles biocompatibles.

Se evaluó el impacto de diferentes procedimientos de producción de perlas (es decir, pH y tiempo de reticulación) en las propiedades físicas de las perlas, centrándose en los tamaños de las perlas, las cavidades internas en las perlas (Fig. 1A) y la densidad de reticulación del polímero en las perlas.

Propiedades físicas de hidrogeles producidos a 3 pH diferentes (pH 3, 4 y 5) y 3 tiempos de reticulación diferentes (1, 2 y 8 h). (A) muestra imágenes microscópicas de fluorescencia verde y luz compuesta de secciones representativas de hidrogel para perlas producidas a pH 3, 4 y 5. (B-D) representan respectivamente la distribución del diámetro de las perlas, el área de la cavidad interna de las imágenes de sección y el coeficiente de decadencia óptica derivado de mediciones de tomografía de coherencia óptica. Los gráficos de violín están normalizados para tener anchos iguales en todas las condiciones.

Los tamaños de las cuentas oscilaron entre 1 mm y más de 10 mm (Fig. 1B), con tamaños medios de cuentas que oscilaron entre 3,6 y 4,18 mm en diferentes condiciones de producción. Los anova no paramétricos mostraron que el pH de reticulación era el determinante más fuerte de los rangos de tamaño de las perlas (R2 = 0,062, p = 0,001). El tiempo de reticulación también tuvo un impacto significativo, pero menor (R2 = 0,014, p = 0,004). Las pruebas de rango de Wilcox por pares confirmaron que las perlas producidas a pH 5 (dmediana = 3,99–4,17 mm) tenían tamaños de perlas medianas significativamente mayores que todas las perlas producidas a pH 4 (dmediana = 3,61–3,71 mm, p < 0,001) y las perlas polimerizadas durante 2 u 8 h a pH 3 (dmediana = 3,60–3,62 mm, p <0,001).

La visualización microscópica de criosecciones de perlas de hidrogel reveló que algunas perlas contenían cavidades internas (Fig. 1A). La fracción de área de estas cavidades dentro de una sección mostró una gran variabilidad entre las condiciones de producción, desde ninguna cavidad observada hasta el 15% del área total de la sección (Fig. 1C). Las perlas producidas a pH 4 tuvieron las fracciones medianas de área de cavidad más grandes (1 h, 4,0%; 2 h, 2,6%, 8 h, 2,4%), seguidas de pH 3 (1 h, 0,9%; 2 h, 0,7%; 8 h, 1,1%) y pH 5 (1, 2 y 8 h, 0,0%). Las únicas diferencias significativas en las áreas medianas de la cavidad se observaron entre las perlas producidas a pH 5 y las producidas a pH 3 o 4, aunque estas diferencias no fueron uniformes en todas las comparaciones por pares (Tabla S.2).

Los coeficientes de decadencia óptica se derivaron de mediciones OCT y reflejan la opacidad de las perlas y la densidad de entrecruzamiento en las perlas de hidrogel. Tanto el tiempo de reticulación como el pH afectaron los coeficientes de degradación óptica (p < 0,001), teniendo el pH el mayor impacto (R2 = 0,82) mientras que el tiempo tuvo un impacto menor (R2 = 0,04). Las perlas producidas a pH 5 tuvieron coeficientes de descomposición significativamente más bajos que las perlas producidas a pH 3 y 4 (p < 0,001 en todas las comparaciones por pares, Tabla S.3), lo que implica que las perlas de pH 5 eran más translúcidas y menos densamente entrecruzadas. Los coeficientes de descomposición en las perlas producidas a pH 3 y 4 fueron más similares, siendo sólo las perlas polimerizadas durante 8 h a pH 3 superiores a otras perlas de pH 3, así como superiores a las perlas polimerizadas durante 1 h a pH 4 (p < 0,01, Cuadro S.3).

El pH de reticulación afectó significativamente las propiedades físicas de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS, lo que sugiere que el pH puede alterar la química de reticulación de PVA-SA. Además, el pequeño impacto del tiempo indica que las etapas iniciales de reticulación gobiernan la morfología final. Durante la producción del hidrogel, se deja caer una gota de PVA-SA en el baño de reticulación (5 % de ácido bórico y 0,7 % de Ca2+). Estos reticulantes actuarán primero en la periferia de la gota, creando una fina capa de hidrogel. Esta capa puede entonces limitar la difusión del reticulante13, ralentizando la reticulación posterior. En perlas con densidades de reticulación más altas (es decir, perlas de pH 3 y 4, Fig. 1D), tales limitaciones de difusión pueden haber impedido en gran medida una mayor reticulación, lo que resultó en las cavidades internas observadas (Fig. 1A, C). En consecuencia, las propiedades físicas de las perlas de hidrogel dependen de las velocidades y la química de la reticulación. La dependencia de las propiedades físicas de la química de reticulación se ejemplifica aún más al combinar los datos de opacidad y tamaño de las perlas (Fig. 1B, D). Las perlas a pH 5 tenían coeficientes de desintegración óptica significativamente más bajos y mostraban menos cavidades, lo que sugiere una química del polímero alterada. Esta química alterada del polímero puede deberse a una reducción de la reticulación de Ca del alginato a pH bajo. La reticulación con Ca del alginato depende de las especies aniónicas, mientras que las estimaciones del pKa para el ácido algínico oscilan entre 2,84 y 4,3632,33. Por lo tanto, un pH más alto puede aumentar la reticulación del alginato, alterando la composición del polímero del hidrogel, así como la posibilidad de una reticulación más completa en todo el hidrogel. Se ha demostrado que los cambios en la composición del polímero y las condiciones de polimerización (p. ej., concentración de ácido bórico, poscurado, etc.) afectan el comportamiento de hinchamiento de los hidrogeles26,27. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de reticulación con diferentes composiciones de polímeros con pH alterado, modulando las densidades de reticulación (es decir, opacidad, Fig. 1D), así como el comportamiento de hinchamiento (es decir, tamaño observado, Fig. 1B).

Estos datos muestran que el pH de reticulación es un factor clave de las propiedades físicas de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS, que pueden estar asociados con cambios en los procesos de reticulación durante las etapas iniciales de formación de las perlas.

El módulo de Young (E) se determinó con elastografía de coherencia óptica (OCE) como métrica de la elasticidad de las cuentas durante la deformación elástica (Fig. 2). Tanto el pH como el tiempo de reticulación afectaron significativamente los módulos de Young (p <0,001), siendo el pH el que tuvo el mayor impacto (R2 = 0,77), mientras que el tiempo de reticulación afectó menos fuertemente a los módulos de Young (R2 = 0,09). Las perlas producidas a pH 5 fueron las más suaves entre todas las condiciones, con valores de E significativamente más bajos (aproximadamente un 60 % de disminución) que las perlas producidas a pH 4 (Fig. 2B). Además, las perlas de pH 5 también fueron significativamente más blandas que las perlas polimerizadas a pH 3 durante 2 u 8 h (p <0,001, Tabla S.4). En particular, las perlas producidas a pH 3 se volvieron significativamente más rígidas con tiempos de reticulación más largos (p < 0,01, Tabla S.4), pero no se pudo observar una tendencia tan significativa para las perlas producidas a pH 4 y 5. En comparación con otros materiales, PVA-SA -Los hidrogeles BS tenían valores E 3 órdenes de magnitud más altos que las biopelículas naturales (40–100 Pa34,35,36), y de dos a seis veces más altos que las biopelículas granulares (12 kPa37), lo que confirma que estos hidrogeles son materiales robustos para aplicaciones de bioprocesos (Tabla 1). La comparación de los valores E de los hidrogeles de PVA-SA-BS con sus geles constituyentes (es decir, alginato o PVA) no reveló patrones claros debido al gran impacto de la concentración del polímero y el método de reticulación. Sin embargo, tanto los hidrogeles de solo PVA como los de solo SA pueden ser mucho más rígidos que los hidrogeles de PVA-SA-BS producidos aquí13,38. Esto resalta que la red interpenetrante de polímeros PVA y SA obtenidos mediante la producción de hidrogel PVA-SA-BS se comporta de manera diferente a los polímeros reticulados individualmente39. Por último, los módulos de Young de los hidrogeles PVA-SA-BS fueron un orden de magnitud más altos que los informes de la literatura para los hidrogeles derivados de EPS, fueron similares a los geles de carragenano y fueron un orden de magnitud más bajos que el agar solidificado (Tabla 1). Anteriormente se demostró que el tratamiento con sulfato aplicado uniformemente en todas las perlas aquí mejora significativamente la durabilidad del proceso de los hidrogeles de PVA-SA-BS producidos a pH 329. En general, los hidrogeles de PVA-SA-BS producidos a pH entre 3 y 5 son materiales robustos con propiedades similares. a muchos materiales existentes similares a hidrogeles naturales y sintéticos. Además, controlar el pH y el tiempo de reticulación puede permitir adaptar las propiedades viscoelásticas de las perlas de PVA-SA-BS a diferentes aplicaciones de bioprocesos.

Elasticidad de las perlas de hidrogel. (A) muestra imágenes representativas de elastografía de coherencia óptica (OCE) obtenidas a 4,0 kHz para cada una de las condiciones. El transductor piezoeléctrico estaba ubicado a la izquierda de la imagen. (B) muestra el módulo de Young medido a diferentes frecuencias (2–6 kHz, puntos grises) y las distribuciones de datos (gráficos de caja).

La difusión de azul de dextrano a partir de hidrogeles se utilizó como sustituto de la difusión de complejos macromoleculares (p. ej., enzimas) en hidrogeles (Fig. 3). Específicamente, podemos interpretar la cantidad total de azul de dextrano liberado por un hidrogel después de la saturación como un indicador del espacio poroso43. De manera similar, las tasas de difusión del azul de dextrano son el resultado tanto de la composición del polímero (es decir, tasas de difusión a través del propio polímero) como de factores de la arquitectura de los poros, como el tamaño de los poros43 y la conectividad de los poros.

Difusión de azul de dextrano a partir de perlas de hidrogel producidas con pH y tiempos de reticulación variables. La concentración de azul de dextrano se midió como DO600 en tubos de vidrio. (A) representa los perfiles de concentración de azul dextrano a lo largo del tiempo para cada tipo de perla; (B) representa la velocidad de difusión de azul dextrano de cada tipo de perla, determinada como la pendiente del perfil de concentración durante los últimos 100 minutos.

El azul de dextrano total liberado al final del ensayo disminuyó al aumentar el pH de reticulación, lo que indica que las perlas producidas a un pH más bajo pueden tener espacios porosos internos más grandes (Fig. 3A). Las perlas producidas a pH 3 liberaron consistentemente significativamente más azul de dextrano que las producidas a pH 5, así como las perlas producidas a pH 4 con un tiempo de reticulación de 8 h (p <0,01, Tabla S.5). Además, las perlas polimerizadas durante 1 hora a pH 3 liberaron más azul de dextrano que cualquier otro tipo de perlas (p < 0,05), lo que indica que estas perlas pueden haber tenido arquitecturas de poros que favorecen tasas de difusión más altas de estructuras macromoleculares.

Las tasas de difusión de azul de dextrano durante los últimos 100 minutos del ensayo de difusión mostraron tendencias similares en el pH y los tiempos de reticulación (Fig. 3B). Las perlas a pH 3 tuvieron las velocidades de difusión más altas de azul de dextrano, con valores consistentemente significativamente más altos que las perlas a pH 5 y las perlas polimerizadas a pH 4 durante 1 y 8 h (p <0,05, Tabla S.6). Nuevamente, las perlas producidas a pH 3 durante 1 h tuvieron la tasa más alta de difusión de azul dextrano, con valores significativamente más altos que todas las demás perlas, excepto las polimerizadas durante 2 h a pH 3 (p <0,01).

Las redes de polímeros de hidrogel imponen limitaciones de difusión para los productos químicos que se difunden desde la fase acuosa a granel hacia el interior o desde el hidrogel hacia el exterior. En aplicaciones de ingeniería, el equilibrio entre las velocidades de difusión y las velocidades de reacción es fundamental para maximizar el volumen catalítico efectivo del sistema (es decir, el módulo de Thiele). Además, en aplicaciones que aprovechan microbios y comunidades microbianas complejas, tales limitaciones de difusión permiten respaldar las funcionalidades deseadas en los hidrogeles4. Si bien estas aplicaciones se benefician del establecimiento de coeficientes de difusión absolutos (D), la determinación de D está limitada por (i) la naturaleza esférica de los hidrogeles y (ii) la estructura interna heterogénea de los hidrogeles (es decir, cavidades). Se han propuesto soluciones para el primer problema23; sin embargo, el segundo requeriría una mejor caracterización de la arquitectura de los poros (es decir, espacio, tamaño y conectividad de los poros), así como las propiedades de difusión del líquido contenido en las cavidades internas. Por otro lado, determinar D en láminas planas de hidrogeles de PVA-SA-BS29 pasaría por alto el impacto de la reticulación basada en gotas en la morfología del hidrogel. En última instancia, el pH de reticulación altera fuertemente las propiedades de difusión de los hidrogeles de PVA-SA-BS, un factor de diseño crítico para los (bio)procesos.

En un proceso simulado de perlas de hidrogel, se monitoreó la pérdida de microesferas fluorescentes (d = 1 µm) como indicador de la retención celular, así como la pérdida de componentes básicos de hidrogel, para investigar cómo las diferentes condiciones de producción de hidrogel afectan el comportamiento del proceso de las perlas (Fig. .4).

Pérdida de representantes de células microbianas y componentes básicos de hidrogel durante una incubación de 30 días. (A) y (B) muestran la pérdida diaria y total de microesferas fluorescentes de perlas de hidrogel, respectivamente. (C) y (D) muestran la pérdida diaria y total de PVA de los hidrogeles, y (E) y (F) muestran la pérdida diaria y total de polímero (expresada como demanda química de oxígeno (DQO)) de los hidrogeles.

La pérdida de microesferas fue mayor en los pasos iniciales de intercambio de líquido (días 0 a 7), pero disminuyó rápidamente en 2 órdenes de magnitud durante este período (Fig. 4A). Después de esta semana inicial, las concentraciones de microesferas continuaron disminuyendo, aunque a un ritmo más lento. A lo largo del experimento, el sobrenadante de las perlas de pH 5 normalmente contenía un orden de magnitud menos de microesferas que las perlas producidas a pH 3 o 4 (Fig. 4A). Como resultado, la pérdida total de microesferas durante toda la incubación (Fig. 4B) de las perlas producidas a pH 5 fue significativamente menor que la de las perlas producidas a pH 4 (p <0,001; Tabla S.7) y las perlas polimerizadas a pH 3. durante 2 y 8 h (p < 0,05 y p < 0,01 respectivamente). Los microporos más grandes y más conectados facilitarán un intercambio más rápido entre el intrahidrogel y la fase acuosa en masa tanto para el azul de dextrano (2000 kDa) como para las microesferas fluorescentes que actúan como representantes de las células (1 μm). Esta interpretación proporciona un contexto para la observación de que los hidrogeles producidos a pH 5 perdieron la menor cantidad de células y tuvieron las tasas de difusión más bajas, lo que indica que la matriz puede ser más uniforme y similar a un gel, asemejándose a los hidrogeles de alginato44. Por otro lado, se ha observado que los hidrogeles de PVA-SA-BS reticulados a pH 3 son más parecidos a esponjas con poros de escala de 10 a 100 µm27, lo que explica sus mayores tasas de difusión de azul de dextrano y pérdida de microesferas. Cabe señalar que otros procesos también pueden tener una pérdida celular controlada. Las perlas polimerizadas a pH 3 durante 1 h tuvieron difusividades más altas (Fig. 3) y una menor pérdida de microesferas en comparación con las perlas producidas a pH 4 (p <0,05), lo que sugiere que la relación entre la pérdida de células y las tasas de difusión del azul de dextrano puede no ser completamente lineal. Además, las microesferas fluorescentes actuaron como sustitutos de las células, pero solo pueden imitar la pérdida celular pasiva y no el crecimiento activo de células microbianas de la matriz de hidrogel. Esto puede verse exacerbado por diferencias potenciales en la química de la superficie y la carga de partículas de estas microesferas en comparación con las células microbianas, que también podrían afectar las interacciones abióticas con la matriz de hidrogel. Independientemente, las tendencias observadas sugieren que el pH de reticulación controla la arquitectura de poros a escala micrométrica de las matrices de hidrogel PVA-SA-BS, alterando su capacidad para retener células microbianas.

Durante la fase inicial también se liberaron bloques de construcción de hidrogel de los hidrogeles. De manera similar a la pérdida de células, los primeros 7 días de incubación liberaron las concentraciones más altas de monómeros de hidrogel, y los hidrogeles producidos a un pH más alto liberaron más polímero (Fig. 4C, E). Las concentraciones iniciales de PVA en el efluente oscilaron entre 604 ± 324 mg PVA L-1 (pH 3-1 h) y 2,46 ± 0,07 g PVA L-1 (pH 5-8 h), mientras que el monómero total de hidrogel (medido como DQO) osciló entre 760 ± 7 mg DQO L-1 (pH 3-1 h) y 3,31 ± 0,02 g DQO L-1 (pH 5-8 h). En todas las condiciones, el efluente inicial contenía cargas de DQO mucho más altas que la mayoría de las aguas residuales domésticas45, lo que implica que el efluente de las fases iniciales de los procesos de hidrogel (a gran escala) debería tratarse por separado. Las tendencias tanto para la pérdida de PVA como para la pérdida total de monómero de hidrogel durante toda la incubación son similares (Fig. 4D,F), y la pérdida de PVA aumenta significativamente al aumentar el pH de reticulación (p <0,01; Tabla S.8), mientras que las tendencias en la pérdida total de polímero (como DQO) fueron menos consistentes a través del pH de reticulación (Tabla S.9). Investigaciones anteriores observaron que las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS producidas a pH 3 perdieron entre 0,026 y 0,073 % de su masa durante una incubación con agitación de 5 semanas sin intercambio de líquido29, similar a las pérdidas totales de PVA observadas aquí (0,03 a 0,09 %, Fig. 1D).

La variación del pH de reticulación creó una clara compensación en las propiedades del proceso, donde las perlas que retenían mejor las células perdían más polímero en las fases iniciales del proceso. Mapear estas compensaciones es fundamental para adaptar las perlas de hidrogel PVA-SA-BS a diferentes aplicaciones de procesos.

Los hidrogeles de PVA-SA-(BS) son atractivos para aplicaciones de bioprocesos que incorporan células vivas y enzimas puras debido a la baja toxicidad del proceso de reticulación4,46 y a la formación de una matriz que permite altas tasas de difusión y crecimiento microbiano27,29. Aquí, presentamos el primer estudio que cuantifica el impacto del pH y el tiempo de reticulación en una variedad de propiedades fisicoquímicas, elásticas y de proceso de las perlas de hidrogel de PVA-SA-BS. Este enfoque único no solo permite identificar las condiciones ideales de producción de hidrogel, sino que también identifica compensaciones en las propiedades deseables del hidrogel que pueden ser el resultado de cambios en la reticulación y la química del hidrogel en diferentes condiciones de producción. En general, el pH fue el mayor determinante de la morfología, reología y comportamiento del proceso de las perlas, lo que podría estar asociado con cambios en la química de reticulación de PVA y/o SA. Si bien estos mecanismos químicos no pueden confirmarse con base en los datos presentados aquí, existen claras consecuencias de estos cambios en la aplicación de estos hidrogeles en entornos de ingeniería (ambiental) (Fig. 5).

Adaptación de las propiedades físicas y funcionales de los hidrogeles de PVA-SA-BS ajustando el pH de reticulación.

El pH de reticulación induce compensaciones entre la pérdida de microesferas y la viabilidad del (bio)catalizador, por un lado (mejor a pH 5), y las velocidades de difusión y la firmeza de las perlas, por el otro (mejor a pH 3/4). Estas compensaciones pueden guiar la selección del pH óptimo para la producción de hidrogel PVA-SA-BS. En aplicaciones que emplean catalizadores microbianos de células enteras, las perlas producidas con pH 5 pueden ser una opción atractiva. La pérdida de células puede ser significativamente menor que la de las perlas de PVA-SA-BS producidas a un pH más bajo, lo que ayudará a (i) maximizar la densidad de biomasa en el sistema y (ii) minimizar las necesidades de filtración posteriores. Al mismo tiempo, la reticulación a pH 5 podría inducir un menor estrés celular –dependiendo del catalizador considerado–, reduciendo el tiempo de arranque y mejorando las velocidades de reacción catalítica29,31. Sin embargo, dependiendo de la química del proceso objetivo, velocidades de difusión más bajas de las perlas de pH 5 pueden limitar las velocidades de reacción, aumentando la huella del proceso y la inversión de capital necesarias, lo que hace que estas perlas sean menos deseables en algunas aplicaciones. Además, las perlas más blandas también podrían degradarse más rápido, lo que requeriría un reemplazo más frecuente en el proceso. Por último, no está claro el impacto de las cavidades internas formadas a un pH de reticulación más bajo en los catalizadores microbianos. Puede ser que tales cavidades den a los microbios espacio para crecer sin perder la retención celular, aunque serían necesarios experimentos específicos que investiguen estas cuestiones para confirmarlo.

En aplicaciones que aprovechan catalizadores químicos a escala microbiana, el bajo pH de reticulación puede ser un problema menor que para los catalizadores microbianos. En consecuencia, la selección del pH de reticulación depende del equilibrio entre retención del catalizador, difusividad y degradación de las perlas. Dependiendo del catalizador químico incluido, la retención del catalizador puede ser más significativa para los catalizadores químicos, ya que no pueden autorreplicarse como los catalizadores microbianos. Un informe reciente también demostró la combinación de catalizadores microbianos y químicos en una sola perla de hidrogel para el tratamiento portátil de la orina47, lo que requiere además considerar las compensaciones entre la retención del catalizador y las tasas de difusión.

Por último, estas compensaciones pueden cambiar aún más en aplicaciones que utilizan catalizadores enzimáticos. Las enzimas catalíticas pueden comportarse de manera más similar al azul de dextrano de 2000 kDa, lo que sugiere que su retención puede mejorarse en hidrogeles de PVA-SA-BS producidos con pH 5, aunque esto tendría que confirmarse experimentalmente. Además, la retención de enzimas en hidrogeles también puede alterarse químicamente, por ejemplo, con la reticulación de glutaraldehído, lo que abre la puerta a oportunidades que combinan alta difusión y retención de catalizador48.

En general, demostramos que la reticulación del pH es un enfoque poderoso para adaptar las propiedades de los hidrogeles de PVA-SA-BS que son fundamentales para optimizar (bio)procesos y tecnologías ambientales. Las compensaciones entre la retención de células, las tasas de difusión y la firmeza de las perlas son factores particularmente críticos para maximizar la eficiencia y la durabilidad del proceso.

Los hidrogeles de PVA-SA-BS son materiales prometedores para la intensificación de la ingeniería de (bio)procesos en una variedad de aplicaciones. Aquí, investigamos el impacto del pH y el tiempo de reticulación en una amplia gama de propiedades relevantes de estos hidrogeles, incluidas las propiedades físicas, fisicoquímicas, elásticas y de proceso. Este enfoque destacó que el pH era el factor más crítico que influyeba en las propiedades del hidrogel, lo que puede estar asociado con las tasas de reticulación de PVA y SA que están influenciadas inversamente por el pH. Esto tuvo resultados significativos en todas las propiedades medidas. Las perlas producidas a un pH más bajo mostraron cavidades internas únicas, mayor opacidad de la matriz y tamaños de perlas más pequeños, lo que puede estar asociado con la limitación de la difusión de los reactivos de reticulación durante la producción de perlas de hidrogel. Las perlas de pH bajo también fueron más firmes (medidas con OCE), lo que sugiere que una reticulación más fuerte del PVA puede haber contribuido a la robustez del hidrogel. Estas perlas más parecidas a gel producidas a pH alto (más alginato, menor opacidad) también mostraron (i) un espacio de poro interno más pequeño, (ii) tasas de difusión más bajas de azul de dextrano, lo que refleja la arquitectura de los microporos, (iii) una retención celular mejorada y ( iv) mayor liberación de polímero durante las fases iniciales del proceso. Estos hallazgos presentan excelentes oportunidades para adaptar las propiedades de las perlas de una manera simple pero efectiva para ampliar el rango de aplicación de las perlas de hidrogel PVA-SA-BS que encapsulan catalizadores químicos, enzimáticos y/o microbianos en ingeniería de bioprocesos.

Según Landreau et al.29, se produjeron hidrogeles de PVA reticulado con ácido bórico y de alginato reticulado con calcio postcurados con sulfato. Brevemente, se preparó una solución que contenía 100 g L-1 de PVA (89–98 kDa, Sigma-Aldrich, EE. UU.), 10 g L-1 de SA (grado BioReagent de algas pardas, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y fluorescente de color amarillo verdoso. Microesferas de poliestireno modificado con carboxilato de 1 µm (FluoSpheres™, ThermoFisher Scientific, EE. UU.) que actúan como sustitutos de las células microbianas a una concentración de 1,41·107 microesferas·mL-1. Esta mezcla se bombeó a un dispositivo casero de goteo de perlas, que consta de puertos con agujas de 24G que gotean gotas de polímero en una solución de reticulación que contiene 50 g de H3BO3 L-1 y 26,5 g de CaCl2⋅2H2O L-1 agitada con un agitador de cabeza. La proporción de polímero total a solución de reticulación se fijó en 1:10 en todas las condiciones. Para investigar el impacto del pH en la formación de hidrogel, el pH inicial de la solución de reticulación se fijó en 3, 4 o 5. Para investigar el impacto del tiempo de reticulación en la formación de hidrogel, se recogieron perlas producidas en cada pH 1, 2 y 8 h después del descenso. Después de la recolección, las perlas se colaron en un tamiz de 600 µm, se lavaron minuciosamente con agua desionizada para eliminar la solución de reticulación y se incubaron durante la noche en una solución de 73 g de Na2SO4 L-1. A esto le siguió un filtrado en un tamiz de 1 mm, un lavado con agua desionizada, una incubación de las perlas durante 8 h en agua desionizada para permitir que el sulfato se difundiera y otro paso de filtrado y lavado. Después del segundo paso de lavado, las perlas se almacenaron en un medio adaptado de estudios de laboratorio anteriores para tecnologías de aguas residuales49, modificado para excluir el carbono y el nitrógeno para minimizar el crecimiento bacteriano, así como fosfato para reducir la desintegración de las perlas mediante la lixiviación de calcio. Específicamente, el medio contenía por litro: 43,4 mg MgSO4⋅7H2O, 35,0 mg KCl, 368,2 mg NaCl y 1 ml de solución de oligoelementos50. Las perlas se almacenaron en la oscuridad a temperatura ambiente hasta el comienzo del experimento.

El tamaño de las perlas de hidrogel se analizó distribuyéndolas en una placa de Petri y obteniendo imágenes con una cámara Sony Alpha 7C. Se calcularon distribuciones de tamaño de partículas de al menos 57 gránulos por condición de producción utilizando las funciones Umbral de color y Análisis de partículas en Fiji51.

Las cavidades internas de la perla se analizaron mediante criosección y visualización microscópica. Las perlas coladas y secadas brevemente se dejaron incubar durante la noche en medio de sección Neg-50 (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, EE. UU.) a 4 °C, después de lo cual las perlas se congelaron a -20 °C. Las perlas individuales se seccionaron en secciones de 5 µm utilizando un criotomo CryoStar NX50. Se utilizó microscopía de epifluorescencia para capturar imágenes de microscopía óptica de las perlas e imágenes de fluorescencia verde de las microesferas fluorescentes encapsuladas. Las áreas de sección total y las áreas de cavidad interna se midieron marcando manualmente áreas de interés con un lápiz digital en una tableta iPad Pro en ImageJ.JS, una versión en línea de ImageJ52.

Las propiedades elásticas de las perlas de hidrogel se caracterizaron mediante un método OCE dinámico53,54,55. Se generaron ondas elásticas en la muestra con un transductor piezoeléctrico modulado armónicamente, y el desplazamiento local en estado estacionario de la muestra generado por las ondas elásticas en propagación se monitoreó con un microscopio de tomografía de coherencia óptica (OCT). Las velocidades de onda se determinaron como la relación entre la frecuencia de excitación (2 a 6 kHz) y la longitud de onda de la onda elástica medida con OCT. Luego se utilizaron mediciones de la velocidad de onda a través de frecuencias para construir curvas de dispersión de velocidad de fase para las perlas producidas en cada combinación de tiempos de reticulación y pH (n = 6–10). Para cada frecuencia, se utilizó la velocidad de onda promedio en cada frecuencia de excitación para cada condición de reticulación para estimar el módulo de Young dependiente de la frecuencia de la muestra con un modelo de onda elastodinámico de estado estacionario basado en elementos finitos55. Debido a que las velocidades de onda eran independientes de la frecuencia, se utilizaron estimaciones de los módulos de Young (E) en todo el rango de frecuencias de excitación para estimar la E media y las desviaciones estándar. En la información complementaria (Información complementaria, S.1.1) se proporcionan más detalles sobre la técnica de medición de OCE y el modelo de elementos finitos.

También estimamos el coeficiente de atenuación óptica aparente para cada categoría de muestra utilizando los datos estructurales de OCT. Los datos de OCT representan la intensidad de dispersión de la luz local. Esto significa que el contraste espacial en los datos es indicativo de cambios locales en el índice de refracción, que a su vez se correlaciona con la densidad local del polímero en la muestra53. Seguimos la variación en el coeficiente de atenuación promedio con el tiempo de reticulación y el pH, asumiendo que la intensidad de la luz disminuye desde un valor máximo en la superficie de la muestra hasta un límite mínimo detectable a cierta distancia debajo de la superficie. Específicamente, la intensidad promedio de píxeles en la imagen OCT se registró primero cerca de la superficie de la muestra y esta medición se repitió a lo largo de un transecto de 100 píxeles (92,1 μm) debajo de la superficie de la muestra. A lo largo de este transecto, la intensidad promedio disminuyó linealmente con la distancia debajo de la superficie. La pendiente de la intensidad de desintegración, que denominamos coeficiente de desintegración óptica, se compara para los diferentes tiempos de reticulación y valores de pH.

Para evaluar las propiedades de difusión de las perlas producidas en diferentes condiciones de reticulación, se desarrolló un ensayo de difusión de azul de dextrano. Primero, se permitió que 0,5 ml de perlas (medidas por desplazamiento de volumen) se equilibraran durante al menos 24 h con una solución de azul de dextrano al 1 % (aprox. 2000 kDa, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Al inicio del ensayo de difusión, se pusieron 0,5 ml de perlas en 5 ml de medio sintético en tubos Balch de vidrio transparente y se mezclaron bien. La densidad óptica a 600 nm (OD600) se midió en un espectrofotómetro inmediatamente después de la mezcla. Posteriormente, los tubos de Balch se agitaron a 120 rpm usando un ángulo casi horizontal y se midió la DO600 cada 2 min durante la primera hora, cada 10 min durante los siguientes 30 min y cada 20 min durante la última hora. Los valores medidos se corrigieron con el valor inicial de OD600. Los ensayos se ejecutaron por triplicado para cada formulación de hidrogel.

Se incubaron perlas de hidrogel en matraces agitados con reemplazo regular de líquido para simular perlas en un biorreactor. Antes del inicio del experimento, las perlas de hidrogel se lavaron con agua desionizada. En matraces de agitación de 250 ml, se agregaron 25 ml de perlas de hidrogel (medidas por desplazamiento de volumen en una probeta graduada) y 75 ml de medio. Los matraces de agitación se incubaron en un agitador a 200 rpm en una habitación con temperatura controlada a 30 °C. Cada 2 a 3 días, se tomaron muestras de 15 ml de líquido para su análisis, se filtraron las perlas y se agregaron 75 ml de medio fresco.

La pérdida de microesferas fluorescentes se cuantificó en cada paso de intercambio de líquido utilizando un citómetro de flujo Guava EasyCyte (Luminex, Austin, EE. UU.) equipado con un láser de 50 mW y 488 nm. Las perlas se cuantificaron utilizando la señal de fluorescencia verde (filtro de paso de banda de 525 nm). La pérdida de PVA de las perlas de hidrogel durante la incubación se cuantificó utilizando un ensayo de yodo azul previamente descrito, modificado en placa de micropocillos56. En resumen, cada pocillo se llenó con 36,4 µl de muestra, 163,3 µl de solución de ácido bórico al 4 % y 27,3 µl de solución de yodo. La solución de yodo se preparó disolviendo 250 mg de KI y 127 mg de I2 en 10 ml de agua MilliQ y dejando que la solución se disolviera durante la noche en un agitador a 30 °C. Después de agregar la solución de yodo, la placa de pocillos se dejó incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de realizar la medición en un lector de placas de micropocillos CLARIOstar Plus (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Cada placa de micropocillos se calibró internamente con una serie estándar de PVA que oscilaba entre 0 y 100 mg de PVA L-1. La pérdida de polímero total en el sobrenadante se midió utilizando kits de prueba de DQO siguiendo el Método estándar 5220D con un límite de detección inferior de 3 mg DQO L-1.

El conjunto de datos que respalda las conclusiones de este artículo está disponible previa solicitud razonable del autor correspondiente (PC).

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PC agradece el apoyo brindado por la Oficina de Ciencias, la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del Departamento de Energía de EE. UU. (#DE-SC0020356). JF recibió el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (1R01DK130815-01). OB y GW agradecen el apoyo final de la Fundación Nacional de Ciencias con los números de subvención CBET 1937290 y CMMI 2100447. Los autores también desean agradecer a Buddy Ratner por sus útiles debates y a Bowen Xie por su ayuda con el análisis de muestras.

Estos autores contribuyeron igualmente: Pieter Candry y Bruce J. Godfrey.

Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de Washington, 201 More Hall, Box 352700, Seattle, WA, 98195-2700, EE. UU.

Pieter Candry, Bruce J. Godfrey, Julia Fudge y Mari-Karoliina Henriikka Winkler

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Oluwaseyi Balogun y George Wells

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PC y BJG conceptualizaron la investigación, diseñaron y ejecutaron experimentos y escribieron el borrador del manuscrito original. PC, BJG, ZW, FS, ED y JF diseñaron métodos analíticos y recopilaron, analizaron, visualizaron e interpretaron datos experimentales. OB, GW y M.-KHW supervisaron la investigación. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición del manuscrito.

Correspondencia a Pieter Candry.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Candry, P., Godfrey, BJ, Wang, Z. et al. Adaptación de perlas de hidrogel de alcohol polivinílico y alginato de sodio (PVA-SA) controlando el pH y el tiempo de reticulación. Representante científico 12, 20822 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25111-7

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Recibido: 15 de septiembre de 2022

Aceptado: 24 de noviembre de 2022

Publicado: 02 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25111-7

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